新冠疫情告诉我们的：侧流免疫层析测定的教训和未来

近日，一组来自世界各地包括英国、美国、新西兰的研究团队在新创办nature reviews系列杂志nature reviews bioengineering上发表了一篇题为“Lateral flow test engineering and lessons learned from COVID-19”的综述文章。在本综述中，研究团队讨论了LFT的设计原则，并强调了在新冠肺炎疫情中使用LFT的关键经验教训，包括可及性、准确性、可承受性、制造、监管和资助。还研究了LFT检测对流行病、地方性感染和抗微生物耐药性的影响，讨论旨在满足REASURED标准的生物工程方法（即，具有实时连接、易于制备样品、价格合理、敏感、具体、用户友好、坚固可靠、无设备或环境友好、可交付给最终用户）。最后总结了研究人员、行业、资助者和决策者的研究与开发（R&D）优先事项。

在新冠肺炎大流行期间，LFT有多个临床和公共卫生使用案例，在有症状的个体中进行检测以确认诊断，在已知暴露的个体中筛查无症状个体，陆地或海洋边界检测以减缓新变种的引入，检测以确定抗病毒治疗的有效性等。

专业使用和自我测试使基于LFT的测试能够扩展到医疗设施以外的社区和家庭。在英国，在不到12个月的时间内使用了2000万次测试，超过了RT-PCR测试（如下图）。然而，相比高收入地区，中低收入地区的采用率大大降低。

LFT的准确度，尤其是敏感性低于参考RT-PCR方法，SARS-CoV-2抗原LFT的灵敏度在34.1%至88.1%之间，总体特异性为99.6%。在分析上，快速抗原测试可以检测到病毒，其水平相当于每毫升约100000至1000000个SARS-CoV-2病毒基因组拷贝。这种敏感性和简单性之间的权衡长期以来限制了对某些病原体使用LFT。新冠肺炎抗原LFT的成功部分归因于SARS-CoV-2的病理生理学（如下图），即其潜伏期短、传播率高、病毒载量高，非常适合快速、频繁的检测。但假阴性新冠肺炎LFT检测结果仍然是一个问题，因此，LFT检测的时间和频率对于早期症状感染和筛查个体（在旅行或大规模集会之前）非常重要，因为感染者可能在前24 小时的LFT检测中呈阴性。

幸运的是，新冠肺炎抗原LFT具有足够的准确性，可以有效大规模检测SARS-CoV-2。然而，为新冠肺炎开发的LFT平台不能自动转移到其他可能流行的疾病，其中许多疾病将更难通过LFT检测。

从新冠肺炎大流行开始，大量资金被用于SARS-CoV-2测试的开发和应用。美国快速诊断加速（RADx）计划在诊断方面投资了超过15亿美元（2020年），包括开发新的诊断技术以提高现有实验室能力。基于共享的序列数据，可以快速开发针对新病原体的RT-PCR测试。相比之下，抗原LFT的开发在最佳情况下需要数周至数月，包括针对目标分析物的捕获受体（通常是抗体）的设计。此外，公司通常开发自己的专利试剂，这导至诊断试剂的国际标准化一直存在问题。参考测量框架和标准开发有助于确保新病原体爆发期间的准确诊断及其可用性。

每月可生产数百万LFT，以负担得起的价格满足全球需求；然而，这种规模的扩大需要对制造业基础设施和时间进行投资。到2020年底，缺乏LFT制造能力是新冠肺炎应对的主要瓶颈。在G7的一份报告中，要求政策制定者在100天内为下一次疫情做好LFT准备，诊断制造能力和监管被确定为需要改进的关键领域。

新冠肺炎LFT自检结果（阳性或阴性）通常未报告，导至检测使用数据和真实病例数未知，从而使监测复杂化。

分析LFT结果的数字方法非常罕见，而且尚未广泛应用。i-sense的一个英国研究团队与非洲健康研究所合作，开发了一个包含11000张现场采集的HIV LFT照片和深度学习模型的图像库，以对结果进行分类，以确保质量。与目视检查相比，这种方法减少了误报和漏报的数量。与英国REACT研究合作，将相同的模型应用于新冠肺炎LFT，并开发了一个工作流程来分析50多万份新冠肺炎抗体LFT自检。

目前，商用LFT无法用于八种已知的具有流行潜力的优先疾病中的四种：克里米亚-刚果出血热、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、尼帕和其他亨尼帕病毒，以及裂谷热。对于剩下的四个，生物工程挑战仍有待解决。低敏感性限制了丝状病毒LFT的使用（例如埃博拉）；拉萨热LFT需要热稳定性；而寨卡LFT可能需要同时检测抗原和IgM以提高特异性。

抗菌药物耐药性的“无声大流行”仍然是一个巨大的全球负担。在全球范围内，2019年，估计有495万死亡与抗菌药物耐药性有关。

目前确定抗微生物药物耐药性和敏感性的方法通常依赖于细菌培养，表型敏感性测试需要在样本采集后36至72小时的周转时间。通过快速、低成本的即时诊断，包括具有数据采集的多路LFT，可以缩短时间。LFT抗微生物耐药性使用案例包括区分细菌和病毒感染的测试，以及诊断性传播感染的测试。然而，用于这些诊断的最佳生物标志物panel通常是未知的；基因型标记并不总是反映表型行为，最相关的抗性突变可能会随着时间和地理位置而改变，这对测试开发和商业化提出了挑战。

LFT需要与其他预防、治疗和诊断工具一起集成在监控系统或护理路径中。数字护理路径可以将LFT自检与健康系统和电子患者记录联系起来，增加了病例检出、报告和回访。

需要新的LFT来诊断各种感染，例如基于尿液的结核病检测、被忽视的热带疾病检测、消除艾滋病毒、梅毒和HBV母婴传播的LFT，以及疟疾LFT，以确保致病物种和基因进化的全面覆盖。

LFT也可用于监测慢性感染和治疗反应。例如，未来能够监测病毒载量的LFT可以使HIV感染者自我监测，糖尿病患者的血糖检测也是如此。基于核酸的LFT也可能适合人类乳头瘤病毒（HPV）相关的子宫颈癌症。除人类健康外，LFT还可以应用于动物健康和环境监测。

生物工程方法有助于提高LFT的灵敏度、特异性、样本采集和数字数据采集。理论和建模方法也可用于研究测试敏感性和特异性的潜在机制。灵敏度可以通过自下而上、目标聚焦的方法进一步提高，例如使用高亲和力受体和扩增策略，以及自上而下的设备工程方法来提高传感器和纳米颗粒读数的信噪比。

样品收集和制备是任何化验的基本步骤，在LFT上测试的样品（包括全血、血浆、血清、唾液、尿液、粪便、阴道、痰、鼻拭子和鼻咽拭子）具有不同的成分，需要在测试设计中加以考虑。整合采血针可以减少部件的数量和锐器的处理。LFT样本垫和缓冲器可以均匀流动，控制样本缓冲或充当过滤器；然而，一些样本（如血清）需要在采样后进行预处理。

样品制备通常包括提取、纯化和浓缩。LFT样品制备方案取决于样品类型、测定、目标和设置，可针对高通量、快速或定点测试进行优化。例如，顺磁性颗粒系统可用于纯化和浓缩，以实现自动化、高通量测试，基于磁珠的商业试剂盒允许快速、定点样品制备。

LFT检测格式与核酸扩增和检测的结合预示着一个高度敏感和特异性传染病诊断的新时代。等温LAMP或RPA扩增可以使用功能化引物与LFT输出相结合，这些方法往往高度敏感；然而，非特异性扩增可能导至特异性降低，并且扩增制剂与LFT试验系结合可能存在兼容性问题。

基于CRISPR的诊断（CRISPR-Dx）系统，如SHERLOCK和DETECTOR，增加了适用于基于LFT的检测范围，并已用于SARS-CoV-2116117的诊断（如下图）。CRISPR-Dx是多功能平台，对于COVID检测比抗原LFT更敏感，并集成了多步骤。最后，由于需要识别COVID变体，CRISPR也被用于检测突变，包括单核苷酸变异。

敏感性和特异性可以通过开发具有高动力学启动率和低非特异性结合的受体配体来提高。金纳米颗粒的尺寸优化、催化纳米颗粒的显色设计以及其他化学修饰可以进一步增加每个颗粒的信号。此外，可以改进读出方法以减少所需的结合事件的数量。使用荧光纳米颗粒LFT通常需要“读取器”。LFT-读取器组合在临床上可能是经济的，尽管需要专门的硬件，但数字连接或使用智能手机摄像头的读取器可以自动捕获结果

智能手机读取结果允许更复杂的LFT配置，包括定量和多重测试，而不会增加用户的复杂性。此外，信息可以链接到每个测量，从而实现实时、地理链接的监控。然而，需要在现有医疗保健路径中广泛使用变革性数字解决方案；这些解决方案需要可接受性、高数据质量和访问；必须克服法律、道德、隐私和数据安全以及组织和员工的障碍。

生物工程将在提高LFT的灵敏度和特异性、实现多路复用和数据采集以及在低资源环境下制造方面发挥关键作用。LFT测试格式与核酸扩增和检测相结合可以提供下一代LFT。此外，可以在LFT中实施新兴技术，例如使用纳米和量子材料提高灵敏度，CRISPR提高特异性，深度学习方法实现数字连接和质量保证。

新冠肺炎通常呈现高病毒载量（和抗原水平），这可以通过当前可用的LFT检测到；然而，使用LFT检测其他疾病可能更具挑战性。重要的是，还迫切需要LFT来检测抗微生物耐药性、与人乳头瘤病毒相关的宫颈癌、急性和慢性感染，以及病毒载量、动物和环境监测。需要全球趋同的监管途径，解决知识产权问题，扩大中低收入地区的通诊断生产能力，以降低成本，并使测试可制造、可获得、可接受和可供社会最广泛的阶层使用。连接到护理路径，在可行和可接受的情况下利用数字技术，并与最终用户共同创建测试是必不可少的。