自动化POCT免疫诊断平台：灵敏度与传统ELISA相当

免疫测定是检测和量化基于蛋白质生物标志物的最重要技术之一，微流体技术由于其便携性、灵活性和成本效益，是实施POCT免疫测定的一种有前途的技术。例如，基于纸张的微流体设备，如测向流动分析（LFA），被广泛用于测试妊娠、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、以及最近的COVID-19。然而，LFA具有低精度和较差的量化能力，因此仅被用于YES-NO测试。其他免疫诊断试验，如酶联免疫吸附试验（ELISA），提供更灵敏和定量的结果。然而，ELISA通常需要复杂操作，这在POCT设置中很难实现。

磁性数字微流控（MDM）以液滴的形式操纵流体，是POCT的首选技术。MDM能够进行大多数生物测定所需的各种液滴操作，如液滴移动、液滴混合、磁珠提取和液滴分配，这有助于开发用于POCT的全功能微流体平台。曾经展示了几种基于MDM的ELISA检测平台，然而，其中没有一个平台可以作为POCT免疫诊断的独立设备运行。

近日，一组来自中国的研究团队在杂志Microsystems & Nanoengineering上发表了一篇题为“DropLab: an automated magnetic digital microfluidic platform for sample-to-answer point-of-care testing—development and application to quantitative immunodiagnostics”的文章。在这项工作中，研究团队提出了一个基于MDM的自动化POCT平台DropLab，该平台集成了一个磁性液滴操纵模块、一个基于成像的光学检测模块和一个可并行分析四个样本的一次性DropLab芯片。为了验证DropLab，研究团队还进行了ELISA检测C反应蛋白、肌钙蛋白C和抗SARS-CoV-2刺突蛋白的人IgG。结果表明，DropLab在微孔板中的性能与常规ELISA相当。DropLab为POCT免疫诊断提供了一种创新的方法，并使MDM技术更接近于可用于实际应用的可行医疗技术。

图片来源：Microsystems & Nanoengineering

DropLab平台由磁性液滴操纵模块、光学检测模块和DropLab芯片适配器组成（如下图）。DropLab包括两组磁体，分别位于DropLab芯片下方和上方，顶部和底部磁体安装在U形机架上，以实现同步运动。光学检测模块包括用于捕获液滴图像的相机和为DropLab芯片提供均匀照明的透射光源。图c显示了DropLab上免疫诊断测试的工作流程。所有需要的试剂都预先加载到芯片上。首先，将样本加样于DropLab芯片的指定位置。之后，芯片被放置在one-size-fits-all适配器中并加载到平台中。然后通过触摸屏从选择预先存储的程序启动测试。测试完成后，结果将显示在屏幕上。

DropLab概况。图片来源：Microsystems & Nanoengineering

DropLab芯片由4个并行单元（图b）组成，可用于在多个重复中测试同一样本或在单个芯片上测试不同样本。主体层包括微孔和微通道（图a），凹陷的微孔将样品和试剂液滴限制在芯片上的指定位置，微通道连接相邻的微孔并建立液滴和微珠移动的路径。覆盖层第一提供了一个相对封闭的空间，防止液滴蒸发。第二，当磁体从上方接近芯片时，顶表面充当液滴和微珠的基底。主体层和大部分覆盖层喷涂有白色超疏水层，有助于液滴和微珠的移动。覆盖层的特定区域未涂覆，以防止白色涂层在图像采集期间阻挡视线。光学检测模块获取芯片上液滴的图像，并通过提取反应液滴的强度信息来分析结果。

DropLab芯片设计。图片来源：Microsystems & Nanoengineering

DropLab主要使用液滴移动和微珠提取来执行基于ELISA的免疫诊断分析。

液滴移动通过在底层关键点之间移动磁铁来实现（图a）。当底部磁体接近时，磁性微珠形成簇。当磁体从当前关键点移动到相邻关键点时，磁性微珠随之移动并拖动液滴。相邻的微孔由微通道连接，该微通道充当辅助表面地形特征。如果微通道相对较宽，液滴可以通过微通道移动到相邻的微孔。如果相邻微孔中有另一个液滴，则两个液滴可以合并为一个。如果微通道相对狭窄，只有微珠簇可以移动通过微通道，导至从液滴中提取磁性微珠（图c）。

研究团队还设计了一种特殊的磁体运动流程，以增强液滴中的混合并提高ELISA中的洗涤质量。混合策略通过在垂直方向上往复移动磁体和在平面方向上环形移动磁体来搅拌液滴中的微珠。微珠运动的效果类似于搅拌颗粒，其搅拌流体以进行有效混合。每个混合循环包括1个往复垂直运动和1个圆周运动。结果显示磁珠可在液滴中有效混合。

DropLab的液滴操控。图片来源：Microsystems & Nanoengineering

为了验证DropLab用于定量POCT免疫诊断，共测试了三个靶点，包括两种蛋白抗原，人C-反应蛋白（CRP）和人肌钙蛋白C蛋白（TnC），以及抗SARS-CoV-2 S蛋白的人IgG。

以抗原（CRP或TnC）检测为例，首先将捕获抗体偶联到磁性微珠上，然后将目标蛋白添加到微孔1中并孵育约15 min（图a）。之后将微珠提取并依次移动到微孔2和微孔3进行两次洗涤。洗涤后，将微珠移至微孔4，以与含有HRP结合的检测抗体的液滴合并，孵育后，捕获抗体、靶抗原和检测抗体在微珠表面形成三明治结构（图b）。然后，将微珠依次移动通过微孔5、6和7进行三次洗涤。之后，将微珠移动到微孔8中并与TMB液滴一起反应。最后提取微珠移动到微孔9，以使停止液液滴返回微孔8与反应液滴合并。含有阳性样品的反应液滴变为黄色，而含有阴性对照的反应液液滴保持相对清亮（图c）。总的周转时间约为45 min.

在DropLab上，针对SARS-CoV-2 S蛋白、CRP和TnC的人IgG检测限为0.091 μg/mL，1.611 ng/mL和235.561 ng/mL，其与微孔板中测试浓度范围的ELISA检测限相似。

使用DropLab进行ELISA反应。图片来源：Microsystems & Nanoengineering

DropLab是一个基于MDM技术的自动化POCT平台。它包括用于自动液滴操作的运动控制模块、用于结果采集的基于图像的光学检测模块和热成型一次性芯片，该芯片比传统微流体芯片更具成本效益。此外，one-size-fits-all的适配器能够容纳各种类型的DropLab芯片，并将适用范围扩展到分子诊断和表型测试。这项研究表明DropLab能够自动执行复杂分析，如ELISA。由于DropLab完全自动化且易于操作，因此非常适合POCT免疫诊断，尤其是在家庭诊所、床边和检查室等初级医疗保健环境中。与现有的POCT免疫诊断设备（如LFA）相比，DropLab提供了更灵敏和定量的测试结果，可以与微孔板中的传统ELISA相媲美。

尽管本文中DropLab仅被展示用于ELISA免疫诊断，但它也与分子诊断和表型分析兼容。各种设计的DropLab芯片都可以安装到适配器中，并加载到相同的DropLab平台上进行测试。由于基于液滴的流体操作简单，DropLab能够并行集成多个反应。此外，由于DropLab系统的简单性，DropLab芯片的材料和制造成本预计将比较低廉。

尽管有这些优点，但在部署DropLab进行现场测试之前，仍需要进一步改进。首先，基于图像的检测范围相对较窄。在当前条件下，DropLab只能用于分析浓度范围超过两个数量级的样本。一个潜在的解决方案是改用化学发光（CL）分析进行免疫诊断，并使用更有效的光学检测器，这也可以显著缩短周转时间。另一个限制与试剂储存有关。目前，所有试剂在低温下以液态形式储存在芯片上，这样的储存条件不适合长期储存，不利于POCT应用。为了解决这个问题，研究团队目前正在探索以干燥形式在芯片上储存试剂。最后，DropLab能够进行样本输入-答案输出测试；然而进一步的分析，如量化，仍在平台外进行。目前正在修改软件，以允许输入用户指定的校准曲线和标准曲线进行自动定量。