IJOS综述！人类唾液生物标志物检测在临床诊断中的应用前景

近日，来自中国的一组研究团队在杂志International Journal of Oral Science上发表了一篇题为“Promising applications of human-derived saliva biomarker testing in clinical diagnostics”的综述文章。该综述主要涉及2016年至2022年关于唾液生物标志物的研究进展，以阐明唾液检测在临床诊断中的应用前景。研究团队还回顾了不同类型生物标志物的最新进展，如DNA、RNA、蛋白质，以给出唾液生物标志物测试的全面理解。

图片来源：International Journal of Oral Science

全唾液是一种复杂的混合液体，含有唾液、龈沟液、上皮细胞、微生物和食物碎屑。流入口腔的最终混合液体主要来自细胞间液和血液。因此，唾液中也可以检测到血液中的各种物质。唾液腺、口腔组织和其他器官的病理学可导至唾液分泌物异常，导至体积和成分变化。它有助于利用唾液中的生物标志物对疾病的诊断、治疗和预后进行研究。

整个唾液中含有99%的水、0.5%的有机物、无机物和许多细胞组分。主要的有机物质由酶组成，如淀粉酶、溶菌酶、过氧化物酶、脂肪酶、激素如皮质醇、细胞因子、免疫球蛋白、粘蛋白、乳铁蛋白等。唾液中物质的组成和比例随生理状态而变化。疾病、饮食和精神状态会导至唾液成分的变化。唾液物质的疾病相关变化有助于唾液在临床研究中的应用，如诊断、治疗和预后。

不同体液的组份。图片来源：International Journal of Oral Science

唾液的高度可及性使其成为生物标志物研究的中心。用于监测心肌梗死的心肌酶检测和用于压力和炎症状态识别的皮质醇也提醒我们唾液在人类衍生生物标志物发现中的应用。唾液检测显示其在口腔疾病、糖尿病、肾脏疾病、肝炎、神经退行性疾病和免疫缺陷疾病中的诊断价值。这些突破主要依赖于唾液和血液之间生物标志物浓度的良好相关性。例如，之前的一篇文章显示唾液和血液中游离皮质醇水平存在显著相关性，因此唾液皮质醇测试能够显示心理生物学状态。下图为唾液的主要生物标志物类型框架。

唾液中不同类型的生物标志物。图片来源：International Journal of Oral Science

DNA甲基化：在2016年之前，已发表的唾液甲基化研究主要集中于癌症、精神病学、环境和生活方式相关疾病。在过去五年中，唾液甲基化研究主要集中于环境暴露（如空气污染和吸烟）引起的变化。有研究表明，吸烟与唾液cg05575921甲基化相关。

呼吸道过敏患者血液和唾液甲基化水平之间存在高度相关性。口腔疾病研究显示，多种基因的启动子甲基化水平与口腔鳞状细胞癌发生的高概率相关。在神经退行性疾病中，Chung等人揭示了五种重要的CpGs。在精神疾病中，唾液BDNF基因甲基化可用于边缘型人格障碍（BPD）的治疗监测。在注意力缺陷/多动障碍中，患有该障碍的儿童显示出VIPR2基因甲基化特征改变。在法医学中，唾液甲基化也是生物样本年龄估计的一个备受关注的生物标志物。Hong等人使用7个CpG标记构建了一个具有高预测性的年龄预测panel模型，平均绝对偏差（MAD）只有3.13岁。

无细胞DNA（cfDNA）以及循环肿瘤DNA（ctDNA）：cfDNA的研究结果表明，细胞死亡率高的个体往往具有较高比例的cfDNA。有趣的是，心理社会压力暴露会导至cfDNA释放水平升高，唾液皮质醇和cfDNA增加之间存在相关性。此外，唾液病原体衍生的cfDNA也可以指示疾病。

ctDNA与肿瘤有关，唾液ctDNA突变在口腔癌中比口咽癌、喉癌和下咽癌中更频繁。研究人员主要关注TP53、CDKN2A、PIK3CA、FAT1和NOTCH1基因。此外，还对非小细胞肺癌（NSCLC）唾液ctDNA进行了研究，结果显示唾液来源ctDNA中的表皮生长因子受体（EGFR）基因突变与血浆ctDNA的突变一致。HPV相关口咽癌（OPC）诊断也可从唾液cfDNA检测中获益。

mRNA表达：唾液转录组测序被认为是唾液诊断的一种新的临床方法。近年来，关于唾液mRNAs标志物的研究主要集中在癌症、法医学、干燥综合征（SS）和牙周炎，以及其他疾病的探索。Li等人首次报道了口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者唾液中7种上调的mRNAs。干燥综合征患者唾液转录组也有显著变化。Hu等人成功地鉴定了3种mRNA生物标记物，有助于区分原发性SS。在牙周疾病中，唾液中检测到几种免疫反应失调相关基因。STLR2、TLR4 、PGRP3、PGRP4、MIP-1α、MMP-2、MMP-9和CD163 mRNA均可能是牙周病的潜在唾液生物标志物。

MicroRNA: miRNA包裹在脂蛋白囊泡中，因此稳定存在于唾液中。在神经系统疾病中，唾液中的microRNA有可能成为自闭症谱系障碍、酒精依赖和脑震荡的生物标志物。在免疫系统疾病中，唾液中的miR-17-5p和let-7i-5p组显示出区分pSS患者和对照组的能力。在传染病中，专注于手足口病（HFMD）诊断的研究结果表明，6-miRNA组的准确率为77.08%-92.86%，4-miRNA组为68.75%-91.67%。

环状RNA: 环状RNA（circRNAs）高度稳定，主要位于细胞膜中。CircRNA已被证明与某些疾病的进展有关，如心血管疾病、糖尿病、慢性炎症性疾病、神经系统疾病和癌症。研究人员在OSCC组中发现了三种上调的CircRNA，是诊断OSCC的潜在生物标志物。由于组织特异性甚至细胞类型特异性特征，唾液CircRNA也被用作法医体液鉴定的生物标志物。将circRNA结合到mRNA图谱中可改进体液的鉴定，并有助于建立一种稳健的多重分析。

lncRNA: 唾液中长非编码RNA（lncRNA）的检测有助于癌症的诊断和预后。lncRNA MALAT1存在于所有相关患者中，表明唾液lncRNA作为口腔癌生物标志物的潜力。胰腺癌患者中，唾液lncRNA HOTAIR和PVT1水平显著高于良性胰腺肿瘤患者和健康对照组。

酶：基于唾液酶法的方法被广泛用于诊断疾病，包括心血管疾病、阿尔茨海默病、口腔疾病和癌症。唾液酶的两个主要焦点是胃蛋白酶和淀粉酶。

胃蛋白酶仅由胃主细胞释放，当发生胃食管反流或咽喉反流时，可在唾液中检测到。

唾液淀粉酶降低与儿童肥胖和炎症标志物增加相关，如MCP-1、TNF-α、IL-6和CRP。此外，实验表明唾液淀粉酶是早期检测口腔癌的潜在生物标志物，以及诊断和监测糖尿病的潜在生物标志物。

免疫球蛋白：唾液中含有多种免疫球蛋白，包括IgA、IgG、IgM和IgE等。唾液中IgA的水平与上呼吸道感染（URTIs）的风险相关，以及可能会预测囊性纤维化患者肺部感染状态的变化。唾液人巨细胞病毒（HCMV）IgG检测具有51%的敏感性和97%的特异性。

糖蛋白类：唾液中的异常糖蛋白与肿瘤生长和进展以及其他疾病有关。在SS患者和阿尔茨海默病（AD）中，唾液糖蛋白有潜力作为候选生物标志物。

C-反应蛋白（CRP）：唾液CRP可能是血清CRP临床诊断的替代生物标志物。除了炎症和传染病，唾液CRP也可能是其他疾病的潜在生物标志物，如痤疮和亨廷顿舞蹈症。

激素：唾液中可以检测到类固醇、非甾体、肽和蛋白质激素。唾液激素的研究时间线如下图所示。

皮质醇已被研究为多种疾病的生物标志物。唾液皮质醇作为一种应激标志物，近年来已成为研究的热点。皮质醇是PD患者非运动症状的有用唾液生物标志物，因为与健康对照组相比，帕金森病患者体内的皮质醇水平大致较高。此外，唾液皮质醇可用于库欣综合征的鉴别诊断，监测氧化应激状态，并识别炎症性牙周病（IPD）。

唾液褪黑素也是昼夜节律的一个指标。白天唾液褪黑素含量的检测和定量可以积极反映一些抑郁症相关炎症标志物的水平，如CCL2/MCP-1、CCL3/MPI-1α和VEGF-A。此外，褪黑素具有保护性、抑癌性和抗氧化性。肺癌和前列腺癌患者唾液褪黑素水平低于对照组。

已经建立了多个平台来测量唾液中激素的浓度。Arevalo等人使用电化学生物平台来同时测定四种与生育相关的靶激素，Xu等人描述了一种LC/MS同时定量人体唾液中七种微量类固醇激素的方法，并显示出优异的特异性和敏感性。随着技术的快速发展，唾液激素的检测在疾病诊断和疾病状态监测中具有广泛的应用前景。

唾液激素的研究时间轴。图片来源：International Journal of Oral Science

根据采集方法，有未刺激的全唾液（USWS）和刺激的全唾液（SWS）。唾液收集方法和装置对不同类型唾液生物标志物的影响总结在文章中。唾液采集方法对核酸分析的影响最小，包括exRNA回收、mRNA表达、gDNA图谱、DNA质量和数量、DNA甲基化水平和表观遗传因子。

除了标准化的收集方法外，适当的储存条件可能是成功分析唾液成分的另一个关键因素。由于复杂的唾液成分，特别是细菌和酶的干扰，必须进行适当的唾液储存。唾液样本应保存在2至8°C的冷包装或装有冰块的容器中，并在24小时内尽快运送至处理实验室，最长48小时。到达实验室后，应立即处理唾液样本，否则直接储存在-80°C。此外，生物标志物的建议保存条件和稳定时间也存在差异（如下表）。

唾液生物标志物在不同保存条件下的稳定性。图片来源：International Journal of Oral Science

本文综述了唾液生物标志物的最新研究进展。RNA生物标志物在各种疾病中的研究最为广泛。然而，在研究团队看来，激素是临床诊断中最有前途的标志物。需要进行未来的研究，以克服昼夜节律造成的波动，并使用方便的可穿戴或便携式设备来监测患者的动态变化。这将对需要多次检测且难以获得血液或其他类型体液的患者大有裨益。