重磅文章丨Nature Reviews：循环肿瘤细胞CTC领域概述

基于血液的肿瘤衍生材料为早期检测、预后和预测抗癌药物反应提供了一种替代的、实时的、微创的方法。比如循环肿瘤细胞（CTC），它们从原发性和/或转移性肿瘤脱落到血液中，最终在远处产生转移。致力于将CTC作为液体活检分析物整个研究领域取得了显著进展，并导至CTC作为生物标志物在临床试验中的转化应用。然而，CTC的罕见性质仍带来了相当大的挑战，因此，其在常规临床实践中的应用一直进展缓慢。将CTC的应用向前推进，以实现其作为抗转移治疗的高准确度和预测性工具的全部潜力，既有机遇，也有挑战。

近日，一组来自瑞士的研究团队在杂志Nature Reviews Cancer上发表了一篇题为“Biology, vulnerabilities and clinical applications of circulating tumour cells”的综述文章。在文章中，研究团队对这一动态领域的最新发展进行了全面的概述。文章重点描述了CTC在血液传播转移中的作用和影响CTC转移潜能的各个方面，包括同型（仅癌细胞）和异型（癌细胞与免疫或基质细胞一起）簇的形成。研究团队进一步综述了CTC检测、捕获和下游分析的现有技术。参考针对CTC的临床试验，讨论了临床转化方面。最后强调了促进转化应用的关键挑战和必要的研究重点。

图片来源：Nature reviews cancer

转移是通过肿瘤细胞直接侵入血管或淋巴系统而发生的，迄今为止，更多的文献支持血液途径作为主要转移途径。转移是一个多步骤过程，取决于原发性肿瘤（或转移性病变）中具有侵袭性、转移能力的细胞克隆，这些克隆通过血管内转移并作为CTC通过血流。转移性扩散的第一个关键步骤是癌细胞侵袭，然后是侵入近端血管（见下图）。通过被动脱落或主动细胞入侵可进入循环系统。尽管多达1 ×106 个癌细胞每克肿瘤组织流入循环，CTC的转移效率约为0.01%。CTC的循环时间通常很短（单个CTC约25–30 分钟， CTC簇约6–10分钟），其中簇的循环时间较短可归因于在远处的快速捕获。

CTC在离开血流后可以作为播散性肿瘤细胞（DTC）到其新的转移部位。决定DTC命运的几个关键因素，比如CTC的解剖特征以及生物学特征的影响，以及在转移灶的微环境对CTC也产生关键影响。

癌症转移级联的逐步进展。图片来源：Nature reviews cancer

CTC簇：聚集不仅发生在CTCs之间，也发生在CTCs和其他细胞类型之间，包括血小板、髓细胞和CAFs（见下图）。CTC与血小板的相互作用可增加血管通透性，以及提供对T细胞和NK细胞介导的清除的保护。CTC与中性粒细胞的相互作用增加其增殖和转移潜力，且促进粘附和渗出血管，以及使CTC免受免疫监测的保护。CTC簇的变化深刻影响CTC转移的能力，突出了干扰转移过程的可能策略。

循环肿瘤细胞簇的生物学特征。图片来源：Nature reviews cancer

CTC的分子异质性：CTC是动态细胞群，从多个肿瘤区域和解剖位置不断补充，从而能够快速评估肿瘤异质性。通过研究CTC的基因组、转录组和表观遗传学特征，可以进一步探索其生物学。例如，单CTC分析揭示了拷贝数变异，治疗靶点（例如HER2）和耐药突变（例如PIK3CA），其仅与同一患者的原发性肿瘤或转移性病变部分重叠。来自不同原发性肿瘤的CTC表现出“预设”的器官特异性，从不同血管部位捕获的CTC呈现出不同的分子特征。CTC表型和分子异质性促进了转移所需的适应性过程。

CTC释放时间：除了上述异质性维度外，CTC的传播动力学正在成为肿瘤细胞传播的一个同样重要的因素。通过时间疗法的概念，已经在临床上研究和探索了肿瘤发病的昼夜节律和生长动力学的作用。这旨在通过在最佳时间给予治疗来提高抗肿瘤药物的疗效。然而，昼夜节律对CTC释放和转移传播的影响最近才被确定，CTC释放由激素水平（例如褪黑激素）的节律性变化决定，这导至睡眠期间CTC计数最高。目前检测CTC的实践假设外周血计数在一天中没有显著变化。这可能导至结果不一致，限制了CTC作为液体活检分析物的临床应用。这表明需要标准化用于预后和预测信息的组织活检的时间，直接影响临床决策。这些发现为重新评估当前活检标准提供了依据，并提出了探索其转化价值的创新性、时间控制的临床试验。

由于CTC的稀有性，捕获CTC仍然具有挑战性，高效的CTC富集对于可重复的下游分析和应用至关重要。

CTC检测和分析方法可分为抗原依赖性和抗原非依赖性方法（见下图）。迄今为止，最广泛使用的方法使用CTC上表达的抗原和循环中其他细胞上最低表达的抗原来实现阳性选择。FDA批准的CellSearch系统和AdnaTest CTC Select都使用基于EpCAM表达的免疫磁性选择。进一步的标记物，包括pan-CK和CD45，分别用于提高敏感性和特异性。磁性活化细胞分离（MACS）技术将抗体包被的磁珠用于CTC捕获。

不基于抗原的检测技术利用物理特性，如大小、电荷、密度或弹性来富集CTC。正在开发多模态方法，以进一步提高灵敏度和特异性。例如，Isoflux结合了流量控制和免疫磁珠，而Cyttel系统是一种基于图像的检测工具，它顺序结合离心、免疫组织化学和荧光原位杂交来识别CTCs。微流体平台Parsortix和CTC iChip还可以与基于标记物的阳性和阴性选择（例如EpCAM、EGFR、HER2和CD45）、成像和显微操作相结合，以分离纯CTC亚组。

循环肿瘤细胞捕获、分析。图片来源：Nature reviews cancer

CTC的脆弱性和针对性：目前消除转移的策略与应用于原发性肿瘤的策略相同：靶向生长和肿瘤发生，而不是转移过程本身。几种临床前研究和未来临床试验设计的想法正在挑战这种真正转移靶向药物。因为转移性癌症是CTC的后代，靶向CTC原则上会直接中断转移进程（见下图）。

靶向CTC的策略有以下几种：1. 使用血管正常化诱导剂靶向缺氧诱导的CTC簇释放，防止CTC渗入/渗出血管；2. 抑制或破坏CTC簇的药物比如尿激酶，Na+/K+-ATP酶抑制剂等，通过破坏血小板/中性粒细胞与CTC的相互作用，降低转移潜能；3. 免疫检查点抑制剂可以标记CTC被T细胞杀死；4. 通过基于时间疗法的设计优化当前可用的治疗机会，以在CTC生产高峰期间实现最大效果。这些方法为未来研究中针对CTC提供了令人兴奋的机会；然而，考虑到转移过程的复杂性，它们在临床环境中的实施和临床价值的证明将需要高度创新和雄心勃勃的试验设计。

循环肿瘤细胞靶向策略。图片来源：Nature reviews cancer

CTC的预后和预测价值：人们对CTC作为精确肿瘤学生物标志物的兴趣越来越大。在所有主要癌症的外周血中都检测到了CTC，并且在乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌以及小细胞和非小细胞肺癌中已经证明了CTC的预后价值，治疗前CTC计数升高可预测无病和总生存期缩短。重要的是，几项研究表明，与基线CTC状态相比，治疗后CTC数量的变化提供了更好的预后信息，治疗后持续存在的CTC会导至更差的预后。除了单个CTC计数外，CTC簇丰度的评估显著提高了接受治疗患者的预后价值。

CTC计数在疾病临床表现前7–9周可检测到，这表明患者的CTC分析有助于预测最小残留疾病和疾病晚期复发，并为早期癌症检测提供工具。CTC的真正威力在于其代表高转移性肿瘤亚克隆的潜力及其作为分子和功能研究最新生物标志物来源的丰富性。

知识及技术挑战：尽管CTC捕获和下游分析似乎可行且具有临床相关性，但所概述的许多技术远未在今天得到常规应用。现有的CTC技术存在局限性，必须解决这些局限性，以便能够有力地进入临床环境。这包括更好地理解表位表达和可塑性，以及解决由于尺寸和变形性差异、CTC纯度低、装置堵塞、所需大量血液、所需时间和自动化困难而导至的细胞损失相关问题。其他挑战涉及功能测定的改进（例如，更有效的培养方法和CTC衍生的异种移植物），以及分子分析的严格验证（例如，考虑随机变化、低测序覆盖率、扩增偏差和高错误率，以及生物信息学方法的变化）。克服这些挑战可能最终推动CTC成为个性化医学的焦点，成为微创但全面的生物标志物信息来源。

另有一项艰巨的任务在于更好地理解肿瘤克隆性及其与CTC的关系。CTC是最具攻击性克隆的一部分吗？它们与治疗决策相关吗？需要分析多少CTC才能提供此类信息？阐明指示血管内和外渗的机制将为抗转移治疗提供替代治疗靶点。CTC检测的时机对于实现有意义和有代表性的液体活检应用至关重要。CTCs的早期传播和癌症并行进展的证据表明，需要详细考虑潜在CTC储库（原发性肿瘤、大转移和微转移病灶以及DTC），以解锁CTC的全部预后和预测潜力。CTC及CTC簇何时以及如何进入休眠状态仍不清楚，这方面需要进一步调查。这一知识可能导至新的生物标志物和治疗策略，以针对最小残留疾病并防止进一步的疾病传播。

CTC研究的优先事项：CTC临床应用的优先事项应侧重于通过液体活检技术来提高癌症的检测。在早期癌症的情况下，这一点尤为重要，但在敏感性和特异性方面面临严重挑战。这可以通过将CTC与其他循环分析物（例如，循环肿瘤DNA和外泌体）并排比较以提高阳性和阴性预测值，或者通过将液体活检与SOC模式进行比较和结合来解决。研究团队预计CTC将在检测治疗靶点或耐药机制（包括纵向监测）的基础上释放其作为患者分层预测生物标志物的潜力。基于CTC读数的治疗决定是否会补充甚至超过基于标准组织活检的治疗决定，需要在介入和时间控制的临床试验中进行测试和验证。

近年来，快速的技术进步使得能够从患者的血液样本中识别和检测罕见的循环肿瘤细胞（CTC），从而开辟了新的研究领域，并为基于液体活检的临床应用带来了希望。CTC的分析揭示了不同的生物学表型，包括CTC簇的存在以及CTC与免疫或基质细胞之间的相互作用，影响转移形成，并为癌症脆弱性提供了新的见解。在这里，研究团队回顾了在理解CTC生物学特征方面取得的进展，并为利用这些发展来设计未来的临床工具以改进癌症的诊断和治疗提供了见解。

转移仍然是改善癌症患者预后的一个巨大障碍。对肿瘤细胞在远处植入肿瘤能力的生物学过程的深入理解正在开始实现，部分原因是对CTC作为血液传播转移前体的严格研究。对CTC簇的早期观察和对其生物学特性的最新解剖突出了其复杂性，但也暴露了脆弱性，因此也暴露了有针对性的机会。要实现CTC的全部潜力，需要从单纯的计数和预测向高度控制的分子表征发展，以开发精确的预测生物标志物。技术和创新可能为加强对罕见但珍贵的CTC种群的检测铺平道路，从而克服目前的诊断和治疗局限性。我们设想未来CTC可能会通过及时识别侵袭性肿瘤亚克隆而在住院分层和治疗决策中发挥关键作用，这与设计高效的癌症治疗方法相关。