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分子诊断中的质粒使用

2023-1-3 17:17| 编辑: 归去来兮| 查看: 4000| 评论: 0|来源: ivd小食堂 | 作者：悠悠

摘要: 不同于蛋白表达中的质粒构建。

1：合成质粒

不同于蛋白表达中的质粒构建。分子诊断中的质粒主要是作为前期筛选引物探针，诊断体系研究定型的阳性模板，后期（部分DNA检测产品）以质粒作为阳性质控品成为产品的一部分。

通过病原体保守基因序列比对，设计好待筛选的引物探针的同时就可以进行质粒合成了。

合成时注意：

（1）不能对待合成目的基因进行优化，目的基因的优化是为了更利于宿主细胞表达蛋白而进行的密码子优化，优化后序列会改变，不能进行优化。

（2）质粒片段大小可以在设计引物扩增片段的基础上再适当延长一段，这样有利于后期需要再设计引物时使用避免重复合成浪费。

（3）默认选择无特殊酶切位点，默认选择厂家提供的克隆质粒载体就好。

目前主流的合成厂商一般使用pUC系列质粒(下图为pUC57质粒图谱），抗性为AMP抗性。合成的基因片段嵌合位置一般在下图红框处（MCS多克隆位点）。

pUC57质粒图谱

合成厂家除了交付一管冻干粉质粒外一般还会交付一支甘油保藏菌株，该菌株一般为大肠杆菌克隆菌株TOP10，DH5α，或者JM109，目前主流厂家一般采用大肠杆菌克隆菌株TOP10。该菌株为含有我们目的片段的质粒的转化菌株，可以进行培养后提取质粒。

2 ：合成质粒和菌株的处理

（1）培养基配制和转接

配制液体 LB 培养基，分装5mL至试管中，塞上试管塞，用灭菌封口透气膜包扎试管口后，121℃、20min
高压灭菌。灭菌完成后冷却至室温待用。取一支含有液体 LB 培养基的试管置于超净工作台，先向试管中加入千分之一培养基体积的抗生素母液（母液浓度100mg/mL
Amp或者50mg/mL
Kan，具体以质粒合成单为准），然后再加入 10μL 甘油菌，置于摇床中，37℃、220prm 的条件下过夜培养。次日取出用于质粒提取。

（2）质粒提取：按照质粒提取试剂盒说明书操作。提取后的质粒用nanodrop等仪器检测浓度和纯度。根据质粒的大小和浓度计算拷贝数并分装储存待用。

（3）菌种的保藏：取一支液体 LB 培养基的试管置于超净工作台，先向试管中加入抗生素，然后加入 1% 经过夜培养的菌体，置于摇床中，37℃、220prm 的条件下培养 6h。取两支冻存管在超净工作台中，向冻存管中加入 500μL 灭菌 50%甘油，然后加入 500μL
培养 6h 的菌体。置于-70℃冰箱保藏。

大瓶液体LB培养基

3 ：大肠杆菌感受态制备及质粒的转化

如果保存的菌株因为一些原因不能生长的时候可以用质粒进行重新转化。把质粒重新转化到大肠杆菌中进行传代和保藏。

3.1 大肠杆菌感受态制备

（1）-70℃保存的大肠杆菌克隆菌株（DH5α，TOP10等）划线于无抗性LB平板，37℃培养过夜。次日挑单克隆于5mL液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

（2）按1%接种量，接种于50mL液体LB培养基，37℃震荡培养至OD600=0.2~0.5。

（3）将培养好的菌液转移至灭菌离心管，4℃，4000prm，离心20min。

（4）用20mL冰浴的Cacl2（0.1M）轻轻重悬菌体，然后冰上放置30min。

（5）4℃，4000prm，离心20min，弃上清。

（6）用3mL冰浴的含30%甘油的Cacl2（0.1M）重悬菌体，在冰上放置1~2h，期间每隔30~40min轻摇离心管避免菌体沉淀。

（7）每管200μL分装于1.5mL离心管（灭菌、预冷），液氮速冻后转入-70℃冰箱保存或者直接放入-70℃低温冰箱保存。

3.2 质粒转化

（1）大肠杆菌感受态细胞获得

自制或者购买。建议购买TOP10或者DH5α感受态，自制的话可以参考大肠杆菌感受态制备方法。

（2）从-70℃ 冰箱中取出分装好的感受态细胞悬液，立即置冰上解冻。

（3）加入质粒 DNA（一般不超过 50ng，体积不超过 10μl），轻轻摇匀，冰上放置 30 分钟。

（3）42℃ 水浴中热击 90s，热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。

（4）向管中加入 1 ml无抗LB 液体培养基或者SOC培养基，混匀后 37℃ 振荡培养 1 小时，使细菌恢复正常生长状态。

（5）将上述菌液摇匀后取 100μl 涂布于含 Amp 的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃ 培养 16-20小时。

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