《Nature Communications》：呼气检测结核全新诊断工具

世界卫生组织和结核病界列出了三个诊断优先事项，包括开发床旁检测生物标记物的肺结核检测方法。大多数常规诊断测试依赖于不容易获得的痰液样本，并且对儿童、HIV感染者和肺外TB患者的诊断敏感性很低。为了实现床旁检测，新的测试应使用易于获取的患者样本，如尿液、血液或呼吸冷凝物。基于血液的诊断包括干扰素-γ释放试验，该试验检测宿主对结核分枝杆菌的免疫反应，并已相对成功地监测潜在的结核。然而，基于血液的检测无法准确区分结核分枝杆菌感染和活动性结核病。

自2015年以来，世界卫生组织建议根据检测到的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）进行尿检，LAM是一种分枝杆菌细胞膜脂聚糖，以帮助诊断HIV重症患者的结核病。然而，尿检的灵敏度不够理想，限制了其在结核病筛查中的应用。一种替代方法是测试呼出气体冷凝物（EBC），与尿液和血液一样，EBC作为一种可用于TB诊断的潜在液体值得进一步研究。事实上，EBC采集简单、相对便宜、无创，不需要专业人员。EBC反映气道液的成分，因此可能含有来自感染性病原体或感染宿主组织的肺部疾病特异性标记物。事实上，此前有报道称，EBC中的脂肪酸、氧化应激和炎症介质图谱可将TB感染的成人和儿童与健康对照区分开来。

近日，一组来自哥伦比亚和法国的研究团队在杂志Nature Communications上发表了一篇题为“A Mycobacterium tuberculosis fingerprint in human breath allows tuberculosis detection”的文章。文章中，研究团队发现结核患者EBC中存在浓度异常高的LAM以及的一组结核分枝杆菌特异性脂质和蛋白质，可以有效地区分结核病患者。此外，对接受抗生素治疗的儿童的纵向研究表明，EBC分析可以实时监测治疗效果。最后，研究团队观察到EBC中的LAM和脂质与体外培养的Mtb相比具有不同的结构，说明人类肺部的杆菌正在使用不同的代谢过程。因此，EBC分析对结核分枝杆菌在肺部感染期间的代谢状态提供了以前全新的见解，并有可用来诊断结核病患者。

图片来源：Nature Communications

由于LAM是尿液中已确定的TB生物标志物，研究团队尝试使用抗LAM抗体检测EBC中的LAM。虽然TB患者尿液中LAM的表观浓度通常在pg至ng/mL之间，TB患者EBC中的LAM表观量在40 ng至947 μg（如下图）。更具体地说，Ad S+（Ad:Adult; S: Smear; C: culture; Ch: children）组中EBC的LAM量在70至947μg之间 ，Ad S-C-组在4至19 μg之间，Ad S-C+组在0.04至1.5 μg之间，Ch S+/C+组在5至12 μg之间，和Ch S-C- 组在0.48至6.4 μg之间。简而言之，来自结核病患者的EBC样本中含有μg的LAM（相当于μg/mL范围内的浓度），远远高于其他患者样本。

TB患者和对照个体EBC中LAM的定量。图片来源：Nature Communications

接下来检查了EBC中基于免疫测定的LAM定量对TB检测的敏感性和特异性（如下图）。通过计算曲线下面积（AUC）来评估整体ROC表现，AUC为0.997（95%置信区间，0.9928至1.002；P < 0.0001）。阈值为64ng/EBC 该ROC分析的敏感性为93.4%，特异性为100%。

EBC LAM分析的表现。图片来源：Nature Communications

纵向研究跟踪了6名接受抗生素治疗的儿童患者（Ch S-C-）3个月。基于抗体的检测显示5名受试者在治疗过程中表观LAM含量下降（如下图）。4名患者在第1个月时显示出低于阈值，5名患者在3个月时表现出低于阈值。相比之下，在从儿童#I收集的EBC中，表观LAM含量并未随时间减少。值得注意的是，该患者的常规抗生素治疗失败。儿童#I随后被转诊为原发性免疫缺陷。

总之，这些数据表明，通过EBC中的免疫测定对LAM进行定量，可以用于检测成人和儿童中的TB，并监测抗生素治疗效果。

EBC分析实时监测治疗效果。图片来源：Nature Communications

详细的结构分析表明，与从体外培养的结核分枝杆菌H37Rv中纯化的LAM相比，来自成人和儿童患者的EBC中的LAM具有相似多糖结构，然而，来自患者的LAM具有显著的不同：（i）具有“非成熟”截短的阿拉伯聚糖侧链末端（Ara5），（ii）没有MTX基序，以及（iii）没有检测到琥珀酰化。对患者LAM结构的分析有助于合理开发或改进针对LAM的诊断抗体或疫苗。

EBC LAM的结构差异。图片来源：Nature Communications

接下来，研究团队通过蛋白质组学分析EBC的蛋白质组分。在从涂片阳性成人（Ad S+）中分析的5个个体EBC中检测到总共1432种Mtb蛋白，不同患者中的蛋白数量从147到1288不等（如下图）。在涂片或培养阳性儿童（Ch S+/C+）中仅检测到23种Mtb蛋白，根据患者的不同，数量从14到17。相反，在分析的每个对照组（Ad健康、Ch健康、Ad肺炎）中的5个个体的EBC中未发现Mtb蛋白。其中许多，尤其是最丰富的，先前被描述为在细菌和/或宿主衍生的细胞外囊中释放。下图还显示了部分蛋白质的结果，GroS（图b）、GroEL2（图c）、GlnA1（图d）、HspX（图e）和SodB（图f）。

结核患者和对照个体EBC中结核分枝杆菌蛋白的丰度。图片来源：Nature Communications

研究团队测试了通过分析患者的呼出气冷凝物（EBC）样本是否可以检测到肺结核。结果发现，EBC中结核分枝杆菌（Mtb）特异性脂质、脂阿拉伯甘露聚糖和蛋白的存在可以有效地将基线TB患者与对照组区分开来。与体外培养的细菌相比，结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖和脂质在EBC中的结构不同，揭示了结核分枝杆菌在人肺中的特定代谢和生化状态。这为合理开发或改进诊断抗体、疫苗和治疗药物提供了重要信息。总之，EBC分析可能有助于跨患者群体的结核病临床诊断，并监测治疗效果。这种负担得起、快速且无创的方法似乎优于痰液检测，并有可能在护理点实施。

EBC中细菌生物标志物的检测符合许多标准，这些标准对于实施床旁检测至关重要：（i）EBC收集简单、快速、经济、无创，不需要专业人员；（ii）尽管呼出的气体可能含有活的Mtb，但EBC样品可以通过向收集装置添加过滤器以无菌方式收集；因此，不需要在高级别生物安全实验室进行处理和分析；（iii）EBC中的Mtb衍生分子非常丰富且非常多样；可使用先前开发的工具对其进行分析。LAM测定就是一个例证：EBC中的LAM含量是尿液中的1000倍。EBC是临床诊断和监测的一个有前途的样本。然而，广泛使用仍需要标准化，以减少非挥发性化合物浓度研究中观察到的受试者间和受试者内的差异。因此，需要定义各种潜在人类生物标志物的正常生理范围。

值得注意的是，LAM结构不是结核分枝杆菌特有的，而是其他分枝杆菌共有的。在某些情况下，评估LAM水平可能不足以确定结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌感染，尤其是在仅检测到微量的情况下。一旦开发出合适的抗体，可以通过将LAM检测与Mtb特异性脂质（如SGL或TbAd）或蛋白质结合来改善这一点。

总之，EBC中细菌分子的检测提供了一种经济、快速的方法，在结核病的早期诊断中似乎优于痰液检测。此外，EBC抽样有可能用于社区病例筛查和实时监测治疗效果。因此，基于EBC的方法在追踪其他肺部感染因素方面具有潜在的广泛应用。