靶向测序！打开超多重PCR的“青铜门”

今年以来，病原靶向测序（tNGS）在临床上比较热门，它是将多重PCR扩增与测序技术结合，能够对待测样本中几十种至几百种已知病原微生物及其毒力和/或耐药基因进行检测。对低浓度的病原微生物的检测，特别是其毒力和/或耐药基因检测，与病原宏基因组测序（mNGS）相比，tNGS具有病原谱范围明确、测序成本低等优势。因此受到了临床检验的广泛关注。

而在今年6月，中检院的发布了一则《关于开展病原靶向测序多重核酸检测技术质量评价联合研究的通知》，准备开展病原靶向测序多重核酸检测技术质量评价预研究。

超多重PCR的终极奥义

从技术路径上看，靶向测序虽然叫测序，但其实有点有属于超多重PCR的范畴，测序仪在整个技术路径中属于结果分析检测的功能，如果要实现超多重靶标的检测，主要有以下几条路径：

（1）PCR扩增+测序仪或芯片

实验室在拿到样本之后，进行全核酸的提取，然后通过多重的探针和引物对核酸中的靶基因进行扩增，然后将扩增完的核酸再通过基因测序仪或芯片杂交仪进行最后的结果分析，此时由于扩增的时候是针对特点的靶点进行扩增的，所以在测序或者芯片检测的时候，能够很好的识别病原体，避免了mNGS的人源基因干扰困境，因此叫靶向测序。

（2）超多重PCR技术

这是从荧光PCR技术衍生出来的一个分支，也是目前非常热门的一个领域，可以通过多色荧光再加熔解曲线综合分析出超多重的靶点，在这个领域目前比较领先的企业是厦门致善；还有一种就是可以通过多孔来分隔反应区域，然后实现超多重靶标检测，比如最近刚刚获批的腾飞基因，就是用这种方法。

市面上常见的靶向测序检测产品

（1）冰缘诊断—GenSeizerTM超多重PCR技术

冰缘诊断自主研发的GenSeizerTM超多重PCR技术已被国内外数家机构用于科研或临床诊断产品的开发，可在3.5小时内完成单管超过1万重的PCR反应。从其官网信息可知，其目前提供的产品有4款，分别能够检测100种、200种、400种以及一款Pro的产品。

（2）金域医学—超多重快速PCR技术

金域医学和金圻睿联合开发的靶向高通量测序（tNGS）技术平台，采用KM MiniSeqDx-CN系统。其将“PCR”和“NGS”的优势结合，采用超多重PCR正向富集目标病原，排除宿主核酸干扰；有效的提升了检测灵敏度，平台测序时间为5小时，相对来说还是比较快的，而金域依托自家的连锁检验所，产品一经推出，便在各地有了广泛的应用，目前主要的产品有上感Plus、呼吸100、神经100、感染1000和TB-NTM。

（3）迪安诊断—Dano-seq靶向多重病原体测序

迪安诊断的靶向测序，采用特异性引物通过多重PCR技术，对目标序列进行靶向富集，结合三代纳米孔测序技术进行实时测序分析，目前能够实现188款病原体和9种耐药基因的同时检测。

（4）华银健康—超多重PCR建库体系

华银健康推出的tNGS产品同样聚焦临床常见的感染病原体，通过设计特异性引物，采用超多重PCR建库体系，对目标序列进行靶向扩增富集，再利用高通量测序进行扩增产物同步检测。目前华银推出的tNGS项目包括5个产品：4个常规靶向检测项目和1个分枝杆菌靶向检测项目。4个常规靶向检测项目分为精简版、基础版、升级版和加强版，不同版本项目检测病原体的种类和检测范围不同。

（5）吉因加-靶向基因测序

吉因加也在积极布局tNGS检测技术，针对特定目标病原靶向检测，降低人源背景噪音，富集倍数增加几十～几百倍，提升灵敏度，实现厚壁菌、胞内菌及RNA病毒的高检出，覆盖35+耐药标志物，实现耐药位点与病原体的对应报出。吉因加tNGS检测技术打造的是一个开放平台，可以与医院合作进行定制化设计、开发。

（6）予果生物-mTB Pro

总体来看，基于多重PCR扩增+基因测序的方式来落地实现超多重靶标检测的产品目前占据市场的主流，这是因为多重PCR扩增和基因测序都是比较成熟的技术平台了，在tNGS应用的过程中，难点也就在探针引物设计和测序数据分析方面偏多一些；相较于多色PCR+熔解曲线的技术平台虽然具备检测成本更低、操作更方便、检测时间更短的优势，但在理论可行的基础上，逐步落地的过程中也会遇到不小的挑战，比如说竞争性抑制、信号收集与鉴别等难题。

与传统基因测序相比较，靶向测序通过设计特异性引物，可以大幅度提升RNA病毒、真菌和胞内菌的检出，人源基因的干扰较小，同时检测费用也更低；但缺点就是操作依旧很麻烦，同时无法识别新的病原体，因此在应对一些病毒溯源、疑难标本排除时就比较受限，不过这不影响其临床应用。

据IVD从业者网调研数据显示，目前市面上的靶向基因检测产品的收费大多集中在800-1500元之间，这个定价其实也抢占了呼吸道多联检的市场定位，对上靶向测序的产品会打掉一部分宏基因的市场，把其中一些不需要用到宏基因的患者分流到小panel的靶向测序；对下靶向测序会打掉一部分呼吸道多联检的市场，把收费在700以上的呼吸道项目收入囊中。

另一方面，随着上海LDT的试点的展开，未来LDT模式将是医院检验科解决这些无证产品的必经之路，而一个好的项目最后都是要被回收到检验科的，因此在这个趋势下，如何定位未来的产品，如何利用时间差就显得尤为重要。