引言 血液肿瘤存在许多致癌驱动因素和亚型，具有病程变化快，短时间内扩散恶化的特性。每年，约有128万人被诊断出血癌，占全球所有新增癌症病例的7%。血液肿瘤中，根据肿瘤的分型，综合继往病史、细胞形态、免疫表型、遗传学特征及临床、治疗和预后特点，分为三大类：髓系、淋系和组织细胞/树突细胞肿瘤。 髓系肿瘤是一组高度异质性的造血系统恶性疾病，主要包括急性髓细胞性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）以及骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）、骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）和骨髓增生异常/骨髓增殖性肿瘤（myelodysplastic/myeloproliferative neoplasm，MS/MPN）等，多发生于中老年人，具有向急性白血病转化风险，危害着人们的生命健康。随着我国人口向老龄化发展，此类疾病发病率有逐年增加趋势。近年来随着二代测序技术在临床的推广应用，大量MPN和MDS/MPN疾病相关基因被发现，为疾病诊断提供了新的克隆性分子标志，从而开启了一个分子诊断（分型诊断）的新时代。真固生物推出的ONCO/Reveal™ Myeloid 58 Gene Panel可以为髓系肿瘤的治疗前及预后环节的应用研究提供全面、灵敏的检测结果，为疾病的诊断分型、预后评估、用药指导及遗传筛查提供重要依据。 Myeloid 58 Gene Panel产品介绍 ONCO/Reveal™ Myeloid 58 Gene Panel基于SLIMamp®专利技术，检测58个髓系肿瘤相关基因，其中包含18个基因的CDS区域和40个基因的热点突变区域。主要用于髓系肿瘤（包括AML、MDS、MPN、MDS/MPN等）的疾病诊断分型、预后评估、用药指导和遗传筛查。 表1. ONCO/Reveal™ Myeloid 58 Gene Panel基因列表
表2.Panel 基本性能参数
*ITD（内部串联重复）突变是FLT3最常见的一类突变最初是在1996年由Nakao等人发现的，是指在基因近膜结构域插入了一段重复序列，通常发生在近膜区的精氨酸残基595附近，位于基因的14/15号外显子上，插入的位点和序列多种多样，长度一般3-400bp不等，总是以三倍的倍数出现，保留了转录本的阅读框（ORF）。插入的重复序列导至FLT3在无配体结合的情况下发生二聚体化并持续自我磷酸化，增强激活酪氨酸激酶活性，使得下游信号通路（RAS/MAPK 、PI3K/AKT等）持续激活，导至细胞增殖失调，促进AML疾病的复发等。 图1. FLT3基因的内部串联重复突变示意图
图2. 实验流程
产品性能验证结果 2019年Pillar公司就该试剂盒的检测性能进行验证，并将相关实验结果和数据发布在当年全球分子病理学大会（AMP Global）的Poster上。 图3. 不同DNA投入量下的文库产量
使用3种gDNA分别进行检测，样本输入量1 ~ 80 ng均能稳定地建库。 图4. 不同DNA投入量下的均一性
2.5 ~ 40 ng样本时，均一度均大于95%。 图5. 不同DNA投入量下的比对率及中靶率
不同DNA投入量比对率始终接近100%，>5ng样本时，即可获得理想的中靶率。 图6. 高GC含量基因区域覆盖度
具有高GC含量的CEBPA基因全CDS均可被Panel所覆盖。 图7. 准确性-SNV、Indel、ITD验证结果
对标准品各SNV、Deletion、Insertion和ITD均有较好的检出效率。 表3. 准确性-FLT3-ITD性能验证
可有效检测标准品和3种细胞系中的FLT3-ITD，测得的最长ITD片段为126bp。 Poster链接：https://pillarbiosci.com/wp-content/uploads/2021/04/Poster-2019-AMP-_-Wang-Myeloid-assay-development.pdf 髓系肿瘤基因检测的临床意义 急性髓细胞白血病（AML） AML是一种罕见的侵袭性血液及骨髓肿瘤，它阻止白细胞成熟，导至“原始细胞”累积，使正常血细胞的空间减少。全世界所有成人白血病患者约有25%归因于AML，在我国，每10万人中就有1-2个人发生，主要是在成年人且病情急重，预后凶险。骨髓细胞形态学、免疫学、细胞遗传学和分子学检测是AML诊断和治疗的基础。AML具有高异质性，基因检测有助于AML的预后分层、微小残留病（MRD）的监测和整体治疗策略的制定。 2006年，FLT3-ITD作为AML患者临床医师推荐使用的检测指标写入NCCN指南，在2010版NCCN指南中明确指出c-KIT、FLT3-ITD、NPM和CEBPA作为AML患者检测指标，2018版NCCN指南中又新增了IDH1、IDH2、P53等检测指标，随着研究的深入，基因突变所带来的临床意义，在不断的被发现和验证，目前已知的AML中最常见的基因突变就包括 FLT3（37%）、NPM1（29%）、DNMT3A（23%）、CEBPA（14%）和 NRAS（10%）等，以下列举了几个常见AML相关基因检测的意义： NPM1：据报道，有28-35%的AML患者伴有NPM1（编码一种核仁多功能蛋白)基因突变，NPM1突变已被证明与NK-AML有关，在NK-AML中发生的频率为48-53%。与野生型的NK-AML患者相比，NPM1突变的NK-AML具有更高的完全缓解（CR）率和无病生存期（EFS）和总生存期（OS），预后与具有良好细胞遗传学的患者相似（如CBF AML）。NPM1突变型AML 的分子组成、病理和临床特征独特，因此，2017年世界卫生组织(WHO)在髓系肿瘤分类将NMP1突变型AML划分为独特的类型。 FLT3：在AML患者中，已发现两种激活FLT3（编码一种受体酪氨酸激酶）突变的类型，包括内部串联重复（ITD，约存在与30%的AML患者中）和酪氨酸激酶域（TKD，约存在与10%的AML患者中）点突变。ITD突变的患者预后不良，完全缓解率和无病生存率会降低；TKD突变预后存在争议，最常见位点是D835。 CEBPA：CEBPA（编码一种转录因子）在粒细胞分化过程中起重要作用。据报道，有7%-11%的AML患者（或NK-AML患者的13%-15%）发生了CEBPA突变，并与预后良好相关，改善了患者的缓解期和总生存期（类似于CBF易位的患者）。但CEBPA突变带来的良好的预后只针对CEBPA双突变的患者而非单突变的患者。在一项研究中报道，CEBPA基因双突变、单突变和野生型AML患者8年总生存率的比率，分别为54%、31%和34%。修订后的2016年世卫组织AML分类重新定义了CEBPA突变，表明双等位基因（双）突变，而不是单一突变与预后改善有关。 DNMT3A：据报道，有18-22%的AML患者存在DNMT3A突变，在NK-AML中，其发生率为29-34%，最常见的突变位点为R882，这种突变也常与NPM1突变和FLT3突变一起被检测到。迄今为止，关于DNMT3A突变的预后意义的数据是相互矛盾的。在总体AML人群和中危风险患者中，一些研究报告显示，DNMT3A突变对生存率没有显著影响，而其他研究则显示对总体人群或特定亚组的预后不良。多项研究表明，与拥有野生型基因的患者相比，DNMT3A突变患者的总生存期和无病生存期显著下降。 AML已发现大量突变基因，96%的初发患者有至少一种驱动突变，86%的患者具有两种以上驱动突变，AML患者常携带多种基因突变，且突变模式复杂，部分基因突变在AML初次诊断前已经发生；DNMT3A、ASXL1、TET2、NPM1和IDH1/2突变被认为是AML发展的早期事件，随着疾病进展，复发AML患者可能发生新的突变基因。因此，国内外权威指南推荐：AML患者初诊和复发时均需进行基因突变检测。 骨髓增生异常综合征（MDS） 骨髓增生异常综合征（MDS）定义为持续血细胞减少伴血/骨髓细胞特征性形态学改变，发育异常的造血细胞对诊断MDS很重要。据资料显示，MDS患者中出现染色体异常核型或复杂核型的几率高达50%以上，而MDS相关联的多种基因突变的发生率则高达80%，包括TET2、ASXL1、DNMT3A、CBL等，其中TP53、EZH2、ETV6、RUNX1和ASXL1任意一种基因的突变都有独立的预后意义，可将这5种基因的突变归入高危组。大概一半的MDS患者通过基因检测可以查出染色体异常等遗传学的改变，没有染色体异变的患者也可能会有基因突变，而且突变的基因越多，疾病快速进展或者发展成AML的可能性就越高。 由于 MDS 疾病的复杂性及方法学限制，核型的检出率仅在50%左右，而从临床研究结果中发现基因突变可以在一定程度上提示MDS克隆性造血，结合核型和基因突变，可以将克隆性造血证据的检出率提高至 90% 以上。因而，可以说在传统方法学基础上更新的基因突变检测，一定程度上弥补形态学和核型分析的重复性差、特异性及灵敏度低等弱点，进而提高了MDS诊断率及危险度分层，因此，基因检测可以让临床医生获得全面的证据，提高首诊的准确率。 骨髓增殖性肿瘤（MPN） MPN是一类以一系或多系骨髓细胞克隆性增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。曾被称为骨髓增殖性疾病（MPD），是一种病因不明的慢性血液病，多见于50~70岁之间的中老年人，病程进展缓慢，常伴有肝脾肿大，易并发出血及血栓，终末期常因骨髓纤维化、全身衰竭或转化为急性白血病等原因死亡。目前这种疾病还不能治愈，但可以像慢性病一样去控制，主要治疗措施是把细胞控制在相对安全的水平，防止并发症的发生。 经典的骨髓增殖性肿瘤（MPN）主要指： （1）真性红细胞增多症（Polycythemia vera ，PV）；（2）原发性血小板增多症（Essential thrombocythemia，ET）；（3）原发性骨髓纤维化（Primary myelofibrosis，PMF）。 大多数MPN患者均有JAK2、CALR或MPL这三个基因突变，WHO（2016）分类标准中肯定了上述三种基因对MPN的诊断价值。因此，JAK2、MPL和CALR突变均被作为MPN的分子学诊断标志，其中JAK2V617F也是目前MPN的治疗靶点。 JAK2：JAK2突变可见于90-95%的PV和50-60%的ET和PMF患者，其中以V617F（exon 14）突变最为常见，约占98%，见于PV、ET和PMF；目前有针对JAK2突变的靶向治疗药物和临床实验，如鲁索替尼（ruxolitinib）已被欧盟等多个国家和地区批准用于治疗PV和ET后的骨髓纤维化，目前尚未在国内上市。Fedratinib（TG101348）也在临床实验中。 CALR：CALR突变主要用于JAK2阴性的ET和PMF辅助诊断，可见于25%左右的ET患者和35%左右的PMF患者中，PV患者中则比较罕见，主要为exon9 的插入/缺失突变，目前已经发现有36种突变。分为1型（52bp的缺失）和2型（5bp的插入），分别占53.0%和31. 7%，均可导至读码框架位移，1型更多见于PMF。 MPL：MPL突变主要用于JAK2、CALR阴性的ET和PMF辅助诊断，以exon 10上的W515L或W515K突变为主，多在ET和PMF患者中出现，PV患者中较少出现，其概率为：ET约 3-4%，PMF约 8-10%，欧美人种比例似乎更高，中国人群则较低。 除了以上三个基因之外，还有很多其他基因与MPN的发病有关，如JAK2E12、ASXL1、EZH2、IDH1、IDH2、SRSF2、SF3B1和TP53等。这些基因突变常与MPN患者的疾病进展、预后、生存期密切相关，其临床意义具体见下图。
ET和PMF的基因检测顺序推荐
JAK2E12、ASXL1等基因突变的临床意义 上海真固生物科技有限公司，由位于波士顿和上海的创始人共同创立，是一家兼具中国文化基因和美国科技背景的精准医疗技术公司，致力于以高通量测序文库制备技术及配套数据分析系统为核心的IVD产品研发转化，以及临床级精准诊断整体解决方案的开发应用。
公司拥有成熟的针对全样本类型的高通量测序“一管”文库制备技术和基于RNA的融合基因检测技术，大幅降低了检测成本；与试剂配套的易学易用的生物信息学分析软件，可以“一键”完成从原始数据到突变列表注释的全部数据分析流程。同时提供从样本提取到报告的全流程自动化、“一体化”院内LDT/IVD整体解决方案。综合技术优势和成本优势的叠加，解决了当前高通量测序技术在应用推广过程中存在的效率低、准确率低、流程复杂、成本高等障碍，使高通量测序可以在院内实现“一天”级实验流和两天级工作流。推动了基因检测在肿瘤、遗传病等领域的普及应用与发展。 目前，公司已获得包括美国FDA、中国NMPA、欧盟CE在内的三地NGS跨癌种通用伴随诊断试剂盒注册证，是全球首家获此殊荣的NGS精准诊断产品供应商。并且已经与包括ILMN、MGI在内的国际主流测序平台及跨国药企开展了IVD、LDT及伴随诊断多方广泛合作，可同时提供IVD/LDT系列标准产品、5000+扩增子一管个性化定制产品和全外包基因检测服务。随着更多跨平台、一体化、临床级精准诊断产品的不断推出，真固生物将和医疗机构、医学检验实验室、药厂、CRO等更多合作伙伴一道，推动精准医疗触手可及，真正实现精准医疗大众化。
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