关于COOH微球标记，EDC和NHS的使用技巧

侧向层析中抗体或抗原的标记是一项关键工艺，作为反应体系的信号来源，抗体或抗原的标记复合物与试剂条的分析性能紧密相关。侧向层析中常用的标记载体有胶体金、荧光素、量子点微球、彩色乳胶微球以及时间分辨荧光微球等。本文中，我们就从抗体与带羧基官能团的时间分辨荧光微球标记入手，来谈一谈其中的一些常见问题和可能的解决方法。

N-乙基-N′ -（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐，简称EDC（图1），又称EDAC。EDC是水溶性碳二亚胺，用于羧基与伯胺的缩合反应，并已获得广泛的用途。EDC在pH 4- 6的环境中活化微球的羧基官能团，继而介导羧基与待标记抗体的伯胺基形成酰胺键，形成羧基微球和抗体的共价结合物（图2）。

图1. EDC的 分子式

(图片来源：https://www.thermofisher.cn/)

图2.  EDC介导的酰胺缩合反应

(图片来源：https://www.thermofisher.cn/)

EDC易吸潮水解，应置于-20℃保存，如发现有潮解现象，建议更换EDC进行活化。EDC配制成溶液后不建议保存二次使用，推荐在微球活化时现配现用。

这里所述一步法是指在EDC活化羧基微球时，同时加入待标记抗体。一步法的优点是反应步骤和时间缩短，但可能会由于以下原因引起蛋白标记失败：

这里所述两步法则是指在EDC进行羧基活化的同时加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）或Sulfo-NHS（N-羟基磺基琥珀酰亚胺），然后去除EDC和NHS，再加入抗体进行偶联。两步法中，EDC和NHS在对羧基官能团进行活化后，可通过离心和清洗步骤进行去除，以排除其对抗体活性的可能影响。同时，NHS可以与EDC活化的羧基形成较为稳定的中间酯，使EDC的介导的偶联反应效率得到提高(图3)。

因此，建议大家在进行羧基微球的抗体标记时，可进行一步法和两步法的对比和比较，必要时可选用含NHS或Sulfo-NHS的两步法，以取得较为理想的标记效率。

图3.  Sulfo-NHS存在下由EDC介导的偶联反应

(图片来源：https://www.thermofisher.cn/)

EDC的活化浓度与微球的表面羧基含量相关，应根据微球厂商提供的表面羧基含量计算EDC和NHS的合适反应浓度，一般按照微球表面羧基含量的1.2~1.5倍EDC用量即可。不足量的EDC易导至羧基不能充分活化，反之，过量的EDC和NHS较难在后续步骤中清洗干净，进而可能影响偶联反应。

团聚的微球可经过探头式超声仪超声处理后重新分散，适当功率和适当时间的超声不会对微球产生损伤，在这里要注意的是，水浴超声仪不能替代探头式超声仪。

在这里想用一个小插曲，以强调超声重悬的重要性。有一次，我们实验室更换了超声仪的探头，未观察到新的探头没有完全拧紧。在实验中按照以往的参数正常超声处理，也没有发现异常。因为轻微或小范围的团聚和聚集不能被肉眼观察到，于是默认超声过程是正常的。但是，试纸条的整体信号很低，可以观察到大量微球聚集在结合垫和NC膜的交界处，当时以为是溶液配方的问题导至微球聚集。花了很久的时间，将试纸条的所有组分和溶液逐一排查，均未能发现原因。后来偶然发现超声仪工作时声音异常，才发现探头没有拧紧，导至超声功率和效率不足，微球未能充分分散，然后在标记过程中肉眼不能观察到这类现象，只有在性能测试时才能发现。

经常在论坛和行业群里看到研发人员提到微球聚集的问题，一般大家都会从溶液配方和组分上去排查问题，在这里也想提醒一下大家，不妨从超声方式、超声功率和时间上做一些排查和优化。

对于大部分抗体而言，微球的活化buffer（常为 50mM MES pH 6.1）也可用作抗体的标记buffer，一般都可得到理想的标记效率。但是，有些抗体需要进行偶联buffer的摸索和优化，以达到较理想的标记效率。以HyTest PCT抗体为例，通过对单抗16B5cc进行标记buffer优化时的数据分析发现，在不同标记pH下，16B5cc的标记效率有一定差别，由图4可见，16B5cc在pH 6.1的MES和pH 8.0 Boric-borax buffer中，标记效率最高，但在pH 6.1的buffer中，其本底最低且S/N最大，因此在选择的几种buffer中，选用50mM MES（pH 6.0）为最佳标记buffer。

图 4.  不同标记buffer对标记活性的影响

看到这个议题，有的朋友会产生疑问，难道标记效率太高也是错？是的，在某些情况下，是需要适当降低抗体标记效率，以达到试剂条分析性能的要求。我们在NT-proBNP的抗体评价中就遇到了这样的问题，当我们按照经验工艺对抗体进行标记，在校准品检测中，出现了较高本底，信号值随校准品浓度梯度变化的区分度比较好，说明抗体的活性较好，且有优化空间；但是，在检测样本时，却出现了高本底，且在低值样本中区分度较差，表现为在低值样本中出现了假阳性和假阴性的无规律乱跳，在中高值样本中同样区分度较差，且信号值过早达到平台期，在这个时候比较容易判断为抗体的相关性不好。在讨论实验进展时，实验室的同事指出：“有没有可能是标记效率太高的原因，导至本底高且区分度不好，降低活性后或许能解决这个问题？”

按照这个思路，我们采取了几种不同的方案以降低抗体标记效率，果然取得了立竿见影的效果。几种不同的方案都能够有效降低抗体标记效率，不同的方法对标记效率降低的效用和效果均不同。在此，我们想与大家分享几种实验思路：

后来我们在复盘中发现，重组兔单抗比较容易发生标记效率过高的情况，可能是由于重组兔单抗亲和力较高，按照常规标记方法常会发生本底高、信号值高的现象。如果不进行反应优化，往往会根据本底高、特异性差这样的表象而做出误判，错过了活性较高的潜力抗体。

因此我们采用降低标记抗体用量的方法对标记工艺进行了优化，使得该抗体的本底降回正常水平且表现出高活性、高亲和力的特点。如图5、图6所示，在其他条件一致的前提下，仅改变标记抗体的标记量，NT-3245-a 代表100μg抗体与1mg微球反应，NT-3245-b代表25μg抗体与1mg微球反应。图5 所示的3245-b 曲线变平缓且0值本底降低了10倍左右；更重要的是，检测样本的相关性得到提高，如图6所示，在3245-b条件下，在低值样本区的区分度不够，假阳性和假阴性乱跳的结果得以修正，抗体的高亲和力活性得以展示。

图5.  不同标记条件对校准曲线的影响

图6.  不同标记条件对样本相关性的影响

综上，本期我们讨论了在抗体与羧基微球标记中可能会导至标记效率低下的一些弯路和解决方法，同时我们还分享了在抗体评价中遇到标记活性“过高”的实际案例和解决方法，希望能够给大家提供一些思路和帮助。