定量PCR和数字PCR：优势和最佳用途

2022-10-13 15:24| 编辑: 归去来兮| 查看: 3820| 评论: 0|来源: IVD分享库

摘要: 使用 PCR 扩增 DNA 是当今实验室的一项基础技术，创新不断将其应用范围从研究实验室扩展到临床。

使用 PCR 扩增 DNA 是当今实验室的一项基础技术，创新不断将其应用范围从研究实验室扩展到临床。定量 PCR (qPCR) 允许对靶 DNA 进行相对定量，并且是一种可靠的、已建立的测试特定序列是否存在的方法（例如，大多数基于 PCR 的冠状病毒测试使用 qPCR）。另一种 PCR 形式，数字PCR (dPCR) 或液滴数字 PCR (ddPCR)，使用类似的化学方法检测 DNA 序列，但在许多微小体积或液滴中进行检测，利用数学的力量提高信噪比。

qPCR和 dPCR 有很多相似之处和不同之处，但在与 PCR 专家交谈时，有几个重要的品质更加突出。这可能会随着时间的推移而改变，因为 PCR 技术在不断发展。本文讨论了当今 qPCR 和 dPCR 技术的优势和最佳用途之间的一些重要区别。

一、灵敏度，以及绝对与相对定量

多年来，定量 PCR 一直是许多应用的黄金标准。然而，dPCR 能够提供更灵敏的测量和目标 DNA 的绝对定量（相对于 qPCR 的相对定量）。“使用qPCR，科学家只能通过将结果与标准曲线进行比较来确定样本中的核酸浓度，”Bio-Rad 实验室数字生物学集团生物制药部门经理 Marwan Alsarraj 解释说。“另一方面，ddPCR 直接量化核酸，使工具更准确，因此对小核酸浓度更敏感。”

这使得 dPCR 非常适合目标存在于复杂样本中的应用，例如分析来自液体活检的循环肿瘤 DNA。“随着目标分子变得越来越少，检测和精确量化这些分子变得越来越具有挑战性，”赛默飞世尔科技dPCR 高级总监兼总经理 Paul Hung 说。“由于 dPCR 自然稀释了许多反应中的分子，因此当给定目标存在于高浓度的非目标分子中时，可以提高灵敏度。”

二、在实验室和诊所中越来越多地使用 dPCR

研究实验室和诊所都受益于 dPCR 灵敏度的提高。“随着细胞和基因治疗研究和开发的不断发展，开发人员越来越多地转向 dPCR 来精确测量不同的目标，包括工程病毒载体、基因编辑事件、质粒和完整衣壳，”Hung说。

肿瘤学和器官移植等临床领域也受益于 dPCR 检测稀有 DNA 的能力，以及量化稀有 DNA 中微小但有显著的倍数变化。例如，dPCR 用于检测癌症患者的循环肿瘤 DNA，并评估细胞和基因治疗的正确剂量。“随着精准医学变得越来越主流，我们预计 ddPCR 将在临床中变得更加普遍，[因为] ddPCR 可以检测肿瘤负荷响应癌症治疗的微小变化，”Alsarraj 说。“例如，使用 ddPCR 进行连续监测可以使肿瘤学家识别治疗后有复发风险的患者。”

三、动态范围和灵活性

尽管 dPCR 可能在灵敏度方面表现出色，但 qPCR 仍然是许多其他应用的最佳选择。“我们建议我们的客户在基因表达中使用 qPCR，因为它的动态范围很广；其量化不同表达水平、区分剪接变体和多重分析的能力；及其高通量应用和自动化的能力，”Alsarraj 说。事实上，它在实验室和监管环境中更为人所知，并广泛用于基因、健康状况或传染病的筛查。

在分析大量样本时，使用 qPCR 也可能比 dPCR 便宜。“qPCR 本质上是一种灵活且具有成本效益的技术，可满足许多研究需求，使研究人员能够选择适合其特定需求的耗材，包括多种反应化学、分析选项和易于互换的塑料，”Hung 说。“在生物制药行业，qPCR 被用于单克隆抗体、疫苗、细胞和基因治疗以及生物仿制药的制造过程中，作为质量控制和基因分析的工具。”

随着不断的创新和广泛的使用，qPCR 的应用只会扩大。“科学家们不断发现使用 qPCR 的新方法，因为它已经从基因表达扩展到制造和诊断的过程测试，”Alsarraj 说。“我们希望随着技术核心应用的成熟，创新将继续下去。”

四、多重应用的进展

尽管 qPCR 曾经在多重检测方面具有优势，但如今却不那么正确了。数字 PCR 正在迅速成为发展更高的多重检测功能的平台——例如，Stilla Technologies 的 naica ^®系统等平台可以运行 30 重或更多的 dPCR 反应。“一些客户可以在 naica ^®系统上运行与在 qPCR 仪器上相同的分析，但他们只运行一次样品并获得绝对定量，而不是依赖标准曲线并不得不重复运行他们的样品，”Stilla Technologies 全球营销和商业运营副总裁 Matthew Grow。“在 naica ^®系统为研究人员提供了查看扩增和检测效率的能力，一直到单个液滴的水平，每个 PCR 反应在他们珍贵的样本中并行发生。”

随着 dPCR 能够检测稀有基因表达或癌症相关的拷贝数变异事件，更多的多路复用可能会揭示更多未来使用的途径。“多重 dPCR 是对当前下一代测序技术的出色补充，可以让医院实验室有机会进行更多的内部患者检测，而不必与外包或集中式实验室合作，”Grow 指出。

qPCR和 dPCR 可能会继续以互补关系存在。“我们已经看到 qPCR 对于监测和管理 COVID-19 大流行的重要性，它将仍然是临床测试实验室、分析开发人员和生物技术行业的重要工具，”Hung 说。“随着 dPCR 技术通过简化的工作流程和更快的回答时间变得更容易获得，它将在需要稳健、可靠和精确量化的用例中得到采用。

本文编辑：Peng

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