《Scientific reports》：用唾液诊断癌症的简单方法

癌胚抗原（CEA）和细胞角蛋白片段-19（CYFRA 21-1）是多种癌症的两种生物标志物，包括肺癌、口腔癌、结直肠癌等。这些抗原的最大优点是它们也可以在患者的唾液中发现。在健康人的唾液中也发现了CEA和CYFRA 21-1，但发现其浓度非常低（0–3 ng/ml）。在癌症患者的唾液样本中，观察到这些抗原的浓度增加超过5 ng/ml。简单而容易地检测CEA和CYFRA 21-1不仅可能是早期诊断终末期疾病的关键，而且可能是监测肿瘤进展和评估不同类型癌症治疗的关键。

近日，一组来自印度的研究团队在杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Simple diagnosis of cancer by detecting CEA and CYFRA 21-1 in saliva using electronic sensors”的文章。本研究报告了一种简单、无标记的电子传感器的开发，可用于检测广泛浓度的CEA和CYFRA 21-1生物标志物。传感器使用rGO（Reduced graphene oxide）以及富氮MEL（melamine），在室温和环境条件下，将抗原滴在rGO/MEL/抗体/BSA装置上，结合抗原后通过传感器的电流变化被视为传感器信号。对设备进行了八种不同浓度的CEA和CYFRA 21-1的测试。开发的原型机用人类唾液样本进行了测试，并确定了所有真实样本中存在的CEA和CYFRA 21-1的浓度。预测的CEA浓度也与人CEA的商业ELISA试剂盒交叉验证。传感器装置获得的令人满意的结果表明其在临床诊断中具有潜在的实际应用。

图片来源：Scientific reports

抗原和抗体是带电粒子，它们的相互作用导至累积电荷密度的变化。因此，检测抗原的一种简单技术是捕捉由抗原-抗体相互作用产生的电信号。

抗体和抗原带有相反电荷，它们的相互作用导至聚集物种的净电荷减少。电荷密度变化的信息被传输到rGO层，如图3b示意性所示。p型rGO层中的净电荷发生变化，这反映为通过rGO/MEL/抗体装置的电流的减少。

传感机制示意图。图片来源：Scientific reports

制造了rGO/MEL/抗体/BSA，并对两种生物标志物的三种不同浓度进行了测试。图a、b显示了装置测试1 pg/mL、20 ng/mL和800 ng/mL CEA和CYFRA 21-1的相对响应。当抗原浓度增加时，富氮的MEL在传感器装置上可固定更多的抗体。

文献报道，癌症患者唾液中CEA和CYFRA 21-1的浓度范围分别为3.3至5 ng/ml至数百ng/ml。健康受试者的标记物浓度较低。在室温下，对rGO/MEL/抗体/BSA生物传感器进行了CEA和CYFRA21-1（1 pg/mL至800 ng/mL）浓度范围广泛的测试，涵盖了癌症和健康人群中这些生物标志物的浓度。结果显示生物传感器的响应随两种抗原的浓度而变化。传感器的响应范围为6.1%至59.1% （1pg/ml至800ng/ml CEA），7.1%到64.1% （1pg/ml至800g/ml CYFRA 21-1）。CEA和CYFRA 21-1生物传感器的检测限（LOD）分别为0.148 pg/mL和0.04 pg/mL。

生物传感器灵敏度。图片来源：Scientific reports

除了灵敏度之外，生物传感器的选择性也是一个重要方面。为了评估传感器的选择性，使用20ng/mL CYFRA 21-1测试rGO/MEL/抗CEA/BSA装置，发现响应为12.7%，接近装置对1pg/mL CEA的响应。用20ng/mL CEA测试rGO/MEL/抗CYFRA 21-1/BSA装置，该装置对CEA的响应为4.43%，响应小于1pg/mL CYFRA 21-1的反应。因此，抗原-抗体结合具有特异性。

生物传感器特异性。图片来源：Scientific reports

通过制备装置并将其保持在4°C下2周，对开发的生物传感器进行稳定性评估。CEA和CYFRA 21-1的传感器响应分别为33.95%和28.7%，这与新开发的生物传感器的响应接近。将本研究中开发的传感器的性能与通常用于检测这些蛋白质生物标志物的其他传感方法的性能进行比较，如下图。开发的传感器不仅提供了一种检测CEA和CYFRA 21-1的简单方法，而且性能优于大部分可用的传感器。

不同生物传感器间的比较。图片来源：Scientific reports

当计算出CEA的响应小于14%或CYFRA 21-1的响应小于16%时，LCD显示绿色，这表明抗原浓度小于5ng/mL且在健康范围内。橙色代表CEA和CYFRA 21-1浓度高于健康范围（5–20 ng/mL）的范围。如果传感器的响应在该范围内，则可能会向用户发出详细测试的警报消息。红色包括CEA的35%以上和CYFRA 21-1的30%以上的所有反应，因为这些反应表明抗原浓度高于20ng/mL，这仅在患者患有癌症的情况下才可能。

用9例口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者的人类唾液样本和5例健康（对照）样本测试开发的原型机。将6μL解冻唾液滴在开发的传感器上，并使用原型记录响应。

观察到OSCC患者唾液样本中CEA和CYFRA 21-1的浓度均大于5ng/mL，健康受试者唾液中抗原的浓度从1pg/mL变化到略小于5ng/mL。在所有测试的14个样品中均遵循文献报道的两种抗原的阈值浓度（5ng/mL）。为了交叉验证所开发原型的性能，使用商业购买的ELISA试剂盒评估了所有真实样品中的CEA浓度。通过ELISA试剂盒获得的结果与通过开发的传感器设备观察到的结果相当。结果表明，电子生物传感器在检测CEA和CYFRA 21-1方面非常有效，并具有用于临床诊断的高潜力。此外，所开发的传感器可以检测低至1pg/mL的两种抗原浓度，这在ELISA试剂盒中是不可能的。

人类唾液样本测试结果。图片来源：Scientific reports

已经广泛研究了几种检测CEA和CYFRA 21-1的方法。其中一种方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），通过显色反应来检测相互作用。虽然ELISA是检测生物标志物的商业可用技术，但它是劳动密集型的，且具有低灵敏度（~0.1 ng/mL），经常导至不正确的结果，因此不适合开发肺癌的POC设备。其他方法包括电化学传感器、电化学发光（ECL）、光电化学免疫传感器和基于表面增强拉曼散射（SERS）的传感器，来捕获抗体-抗原相互作用。然而，除电化学传感器外，其他方法需要大型设备、设施和熟练专业知识，且成本高昂。电化学传感器具有相对简单的操作和便携式的优点，但需要电解质（主要是液体、悬浮液或胶体）进行操作，因此寿命有限。此外，装置小型化受到限制。因此，这些方法都不适用于癌症POC装置。

本研究报告了一种简单、无标记、快速和有效的方法，通过监测通过rGO/MEL/抗体/BSA传感器的电流变化来检测CEA和CYFRA 21-1抗原。在室温下测试了两种癌症生物标志物的八种不同浓度，范围在1pg/mL和800ng/mL之间。对于1pg/mL至800ng/mL CEA，rGO/MEL/抗CEA/BSA装置的响应在7.29%至59.1%之间变化，对于1 pg/mL至800 ng/mL CYFRA 21-1，rGO/MEL/抗CYFRA/BSA装置的响应范围在6.1%至64%之间变化。LOD分别为0.148pg/ml和0.4pg/mL。传感器对各自抗原具有高度选择性，即使在测试14天后也稳定。使用14个样本测试了开发的原型机，发现预测的CEA浓度与商业购买的ELISA试剂盒非常一致。希望这项研究将导至便携式和易于使用的POC设备的开发，用于检测癌症生物标志物，从而可能导至晚期疾病的早期诊断。