前沿 | 下一代PCR技术？全光学等离子体快速PCR技术可在10分钟内完成检测

初创公司Rover Diagnostics的目标是在POCT领域掀起波澜，其仪器结合了新型光学热循环和检测。全光学实时PCR技术使系统和检测方法的商品成本都很低，该公司预计最初将以一种CLIA豁免的COVID-19测试进入传染病检测领域。

据RoverDx联合创始人兼CEO Mark Fasciano称，该系统被称为LightSpeed，可以在大约25分钟内完成从样本到结果的实时PCR，仪器的商品成本为1500美元，每项检测的成本约为5美元。

Rover Diagnostics由Fasciano和哥伦比亚大学的生物医学工程师Sam Sia于2018年底创立。Fasciano说，该公司位于纽约市，成立的目的是将LightSpeed商业化。

据Sia称，LightSpeed仪器采用了质子纳米粒子热循环和基于荧光测量的光学读数的组合。它也是便携式的，大约有2磅重。

质子纳米粒子可用于诊断学的不同方面，例如作为生物传感器的检测技术。

Rover的系统不是把它们用作传感器，而是利用质子金纳米棒将光转化为热。这些微小的颗粒与PCR试剂混合在一起，在红外LED灯的照射下发出热量，这样，在冷却风扇的脉冲下交替闪烁灯光，就能实现热循环。

这些颗粒以前曾被用于PCR反应，但通常情况下，由于纳米颗粒的荧光猝灭特性，它们只在分离出纳米颗粒后被用于单倍体终点PCR。

研究小组发现，调整颗粒的浓度可以绕过这种猝灭。他们还使用了一种独特的荧光方法，结合光谱仪来读取多个波长，从而实现了实时多重检测。

Sia说：“我们在一个波长上进行激发并读取整个光谱。然后我们再把特定的波长解卷回来。”

这种方法也有助于加快测试速度，因为它不需要更换滤光片或读取多个波长。而且，测试是免提取的，这也使得工作流程更快。

在上个月发表在《Nature Nanotechnology》上的一项研究中，Sia和他的团队开发了一种COVID-19检测方法，从唾液和鼻拭子中检测N1基因上的一个目标。除了对该仪器进行概念验证研究外，该团队还表明，与使用赛默飞QuantStudio 6 Pro仪器进行的qPCR测试相比，它在一组临床样本上具有100%的灵敏度和特异性。

关于LightSpeed的25分钟样本到结果的时间，Sia指出他的团队还没有将该系统推到极限。其他研究人员已经使用等离子体纳米粒子在几分钟内用纯化的DNA驱动PCR。

事实上，蒙特利尔麦吉尔大学的一个小组已经发表了一种使用纳米粒子的方法，在20 μL标准样本量的情况下，在不到一分钟的时间内运行30个PCR热循环，尽管该小组指出，还需要更多的工作来开发能够以这种速度有效延长DNA的聚合酶。

麦吉尔大学的团队在一次会议报告中描述了使用他们的方法进行的实时监测，这是与金纳米粒子供应商Nanopartz合作进行的。

麦吉尔大学电气和计算机工程系教授、描述一分钟方法的研究报告的通讯作者Andrew Kirk在一封电子邮件中说，RoverDx自然纳米技术研究是“非常令人印象深刻的工作”。

等离子体PCR环境中的荧光多重检测是具有挑战性的。Kirk团队开发的系统使用了激光而不是LED灯，而且，将LED方法扩展到一个多通道系统可能更困难。麦吉尔大学已经将这项技术申请了专利，它已经被推进到多通道等离子体PCR原型。

图1 | 多重实时等离子体RT-PCR的总体概念和设计。

（a）多重实时质谱RT-PCR的示意图，由作用于AuNRs的红外LEDs驱动加热，并由12V风扇辅助冷却。AuNRs悬浮在0.2毫升PCR管的溶液中，迅速吸收LEDs的光并将其转化为热量，从而实现快速PCR热循环。一个488nm的激光器和光谱仪设置提供了实时的荧光检测，并在每次退火/延伸保持结束时进行测量。

（b）仪器的示意图。一个PCR管被低成本的光学元件所包围，没有珀尔帖加热元件。该仪器的主要部件包括一个薄壁PCR管，周围有三个红外LED模块，一个冷却风扇，以及一个488nm激光器和分光光度计，用于荧光检测。三个红外LED模块由连接到散热器以及散热器风扇的850nm红外LED组成，并同心地放置在PCR管周围。温度控制可以通过线状热电偶的闭环感应或通过非接触式开环控制来实现。

（c）荧光仪系统示意图。来自488nm激光器的光在到达PCR管之前通过准直透镜和过滤器。从管子里发出的光经过一个聚光镜和一个500nm的边缘发射过滤器（Semrock），然后通过一根光纤到达光谱仪。

（d）图中描述了系统内各部分的非重叠光学光谱，即488nm的激发峰、三种发射（520、555和610nm）、红外LED激发和AuNR吸收。

Rover系统可能与麦吉尔大学团队的工作有些不同，这是因为Rover正在将一个用于临床诊断的系统商业化，而不仅仅是研究用途，所以更加关注性能目标，特别是灵敏度和特异性。

此外，由于RoverDx正在建立一个CLIA豁免的低复杂度设备，整个工作流程，从测试注册、LIS整合、临床灵敏度和特异性、多重荧光测量和结果报告，将非常重要。

Rover团队还经营着第二家公司，名为Rover实验室，提供端到端的诊断测试服务。

例如，该公司签约为200多所新泽西州的公立学校提供COVID-19测试，使用唾液样本和Fluidigm测试，实验室地点在新泽西州的Monmouth Junction。Fasciano说，包括PCR和抗原测试，该实验室在今年上半年已经提供了大约100万次测试。

该公司还销售一种基于云的LIS系统，名为CloudLIS。该系统支持高通量测试，并与其他商业诊断系统配合使用，但最终也将被整合到LightSpeed系统中。

Rover实验室也在帮助了解RoverDx的营销目标和用户需求。

Sia于2014年在《Lab on a Chip》上发表了一篇关于基于微流控技术的POCT诊断商业化的评论。当然，在随后的八年里，生态系统已经发生了变化，大流行病加速了发展，几十个新系统得到了资助和启动。

在去年的一篇评论中，Sia和同事们比较了21个不同的POC系统开发者的设计选择。

“COVID加速了我们一直看到的护理点的许多趋势。这既发生在技术层面，例如新型检测化学试剂和连接仪器，也发生在非技术层面，即报销、监管指导、立法和首选临床工作流程的变化。”

一个系统要想成功，技术必须运行良好，但它也必须适合客户的工作流程，以一种有用的方式提供数据，并有一个有竞争力的价格。

同时，COVID还没有消失，估计也很难消失，同时还有其他传染病，以及数字和消费者健康的趋势，只要设备符合市场需求，就能支持一个不断增长的市场。

该公司的目标是每周进行10到400次测试的客户和四个具体的使用案例：学校、交通部门和惩戒部门的市政用户，以及药房、医生办公室和辅助生活设施的报销用户。该公司还希望将目标放在开发辅助诊断的私营企业和合同研究组织上。

Fasciano说，RoverDx已经筹集了大约450万美元的种子轮投资，并且还在2020年获得了RADx-Tech公司的第一期资金。与此同时，Rover Labs现在是一个盈利和增长的企业。

该公司的监管计划是将该系统与COVID-19测定一起提交给美国食品和药物管理局进行紧急使用授权，同时还计划在未来将其菜单扩展到其他传染病。