洞察 | 纳米孔测序 vs DNA甲基化！会为肿瘤基因诊断带来新的革命嘛？

研究人员正在扩大使用纳米孔测序的范围，两项新研究探索了其在无细胞DNA（cfDNA）甲基化分析中的应用，以确定癌症特定的表观遗传变化。

斯坦福大学医学院的一个小组开发了一种技术，在单分子水平上描述无细胞DNA的表观遗传特征，而耶路撒冷希伯来大学的一个小组开发了一种识别癌症特异性甲基化变化和细胞来源的方法。

在BioRxiv网站目前提供的一份预印本研究中，斯坦福大学的研究人员Billy Lau和他的同事使用了一种无扩增的方法来测量本地的表观遗传特征，这些特征有可能应用于早期疾病检测、治疗反应和最小残余疾病监测等方面。他们的技术适用于牛津纳米孔的PromethIon平台，还将每个样本的读数测序数量提高了一个数量级，超过了该公司的传统方案。

Lau说：“对使用纳米孔测序来观察无细胞DNA的甲基组，我们非常感兴趣，但其中一个问题是测序读数的产量不会像Illumina那样高，但是我们想看看能找出什么信息，这对癌症疾病负担等事情是否可行，以及你是否能纵向跟踪它们，这也可以促进治疗反应监测或甚至早期癌症检测。”

对这种甲基化分析至关重要的是，纳米孔技术通过避免PCR扩增，能够更直接地观察到分离的cfDNA的原始状态。

斯坦福大学的研究人员在验证了他们在实验室破碎的cfDNA的方法后，分析了20名结肠直肠癌患者的血液和组织样本，区分了与已知的癌症相关现象相一致的基因水平甲基化特征，如免疫标记基因的甲基化增加和致瘤调节基因的甲基化减少。

健康和癌症相关样本之间的统计学意义上的甲基化差异确定了致癌Myc途径中的许多基因，表明甲基化变化是癌症特有的。

在澳大利亚Walter and Eliza Hall医学研究所研究表观遗传学但没有参与目前研究的高级研究人员Quentin Gouil在一封电子邮件中指出，像斯坦福大学团队描述的那样减少成本和覆盖面将会导至非常稀疏的数据集。

“这意味着单个位点的甲基化估计并不可靠，相比之下，经常用于生物标志物的甲基化阵列，如表观遗传钟，在基因组的目标位点实现了高覆盖率，因此它们产生了每个位点的稳健估计。因此，虽然都作用于‘作为生物标志物的DNA甲基化’这样的相同模式，这两种技术提供了非常不同的数据，所以需要进行不同的分析。”

Lau解释说，这可能不像Gouil所说的那样是一个缺点，因为他的团队的低通方法覆盖了更多的甲基化位点，可以预期会有更多的信息。

“在我们看来，对许多位点进行测序比精确确定单个位点的甲基化更有参考价值。因为DNA甲基化在整个基因组中是相关的，反映了恶性细胞的整体转录程序，通过捕捉更多和更有信息量的位点，我们可以得到对肿瘤负担的更好估计。”

对于低起点输入是否会导至库的大小不足以运行单个样本的问题，Lau表示，PromethIon仪器并不会对负载不足报错，从而停止运行，所以加载较小的数量不是一个大问题。

他的研究小组经常进行纳米孔测序，每个流动池的cfDNA量远低于50到150飞摩尔，这并没有问题。

“在逻辑上的极端情况下，在PromethIon上运行单个样本甚至比在单个MinIon芯片上运行更有意义，因为你在PromethIon芯片上有5到8倍的孔数，所以即使你负载不足，也会得到更多的数据。”

尽管斯坦福大学的团队将其文库制备方案与牛津纳米孔的LSK110试剂盒配合使用，但Lau说他们的解决方案对未来的纳米孔适配器是灵活的。

这种前瞻性思维可能被证明是有用的，因为Gouil指出，特定的化学试剂已经被LSK112和LSK114试剂盒取代，这两种试剂盒都包括一个高捕获适配器，以进一步减少人们必须加载到流动池的库的数量。

“通过将这种新的高捕获适配器与本文中开发的方案调整相结合，看看我们能做到多低的投入将是非常有趣的。”

Lau表示同意，他说：“Kit 14/R10.4.1（LSK114）化学试剂真正令人兴奋的地方是你有‘马拉松’流式细胞，它可以运行更长的时间，给出更高的数据产量。太平洋生物科学公司也有一个甲基化检测工作流程，用于像这样的应用。”

“由于他们的HiFi化学技术，他们的错误率要好得多，这很好，而且，我发现牛津纳米孔的平台在这种情况下最容易操作。虽然在我看来，牛津纳米孔在提高产量方面有更清晰的技术路线图，但从技术上讲，真的没有任何理由不能用PacBio来做这样的研究。”

Lau和他的同事们目前没有计划将他们的技术商业化，尽管他评论说已经有一些关于这个话题的早期讨论。

“没有什么是固定的。”，他表示。

以色列耶路撒冷希伯来大学的教授Benjamin Berman在评论斯坦福大学的研究时说：“我认为这非常令人兴奋。据Berman称，该领域的技术挑战之一是在具有类似DNA输入的样本中实现一致的测序覆盖。”

也就是说，他认为斯坦福大学研究中描述的方法是经过优化的，可以提供更高的测序覆盖率和更一致的读数数量，这真的很重要。

上个月，Berman的团队还在《Genome Biology》上发表了一项研究，利用纳米孔测序检测cfDNA中的起源细胞和癌症特异性甲基化特征。

在他的研究中，Berman和他的合作者回顾性地分析了6名转移性肺腺癌患者和7名健康对照者的cfDNA样本的测序数据，这些样本之前接受了约0.2倍覆盖率的浅层纳米孔全基因组测序。

虽然该研究的样本量太小，无法确定纳米孔cfDNA甲基化测序与Illumina亚硫酸氢盐测序相比的灵敏度和特异性极限，但结果显示，样本可靠地保留了细胞类型特异性和癌症特异性甲基化特征，以及拷贝数改变和癌症特异性片段化特征。

Lau说，虽然希伯来大学的研究人员更多关注的是生物特征，但他和他在斯坦福大学的团队的目标是进行更多的转化性检测。但是，很高兴看到多个小组在测试纳米孔测序技术能做什么的极限。

与Illumina亚硫酸氢盐测序相比，Berman认为纳米孔在剖析cfDNA甲基化方面有一些“非常有吸引力的特点”，尤其是在临床上使用。

首先，样品处理简单，规避了亚硫酸氢盐转化和PCR，使工作流程更容易被用于常规的临床应用。此外，由于亚硫酸氢盐处理倾向于大幅降解DNA，由染色质结构决定的细胞类型特异性片段“可能会有严重的偏差”。

尽管如此，Berman还是注意到了使用纳米孔测序来检测cfDNA甲基化的一些挑战。据他说，最大的障碍是，由于cfDNA通常尺寸较短，大约150 bp到200 bp长，它对使用纳米孔测序分析甲基化概况构成了障碍，纳米孔测序更适合检测较长DNA分子的甲基化。

此外，尽管Berman认为快速发展的纳米孔测序是“一项极其令人兴奋的技术”，但测序化学的快速更新使研究人员有些难以跟上。

他说：“你已经可以看到悬崖的尽头了…事情会因为这些变化而产生大的批量效应。我肯定认为他们必须为临床应用稳定下来。”

就错误率而言，Berman说纳米孔测序检测甲基化的错误率与Illumina亚硫酸氢盐测序的错误率“相当吻合”。然而，除了甲基化之外，当涉及到识别cfDNA中的单核苷酸突变时，纳米孔测序的准确性与Illumina或太平洋生物科学公司的测序相比仍然“稍差”。

尽管如此，Berman指出，PacBio测序将成为纳米孔测序在cfDNA分析方面的“一个重要竞争对手”，因为前者具有“非常高的碱基质量”，这对检测cfDNA中的点突变是有利的。

除了高精确度，PacBio测序还证明了其在检测超长cfDNA分子方面的效用。在5月发表在《Clinical Chemistry》上的一项研究中，香港中文大学的研究员Dennis Lo和他的合作者证明了太平洋生物科学公司的单分子测序可以实现长的cfDNA检测和对癌症患者的直接甲基化分析。

在该研究中，Lo的团队将PacBio单分子实时（SMART）测序技术应用于13名肝细胞癌患者、13名慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者和15名健康对照组的血浆样本，随后进行片段大小和甲基化分析。

该研究报告说，PacBio SMART测序能够检测到癌症样本中以前未被识别的长cfDNA群体，最长的肿瘤cfDNA是13.6kb。虽然对这些长DNA分子的直接甲基化分析实现了对单个血浆DNA分子的组织来源分析，但研究人员还说他们能够利用这些长血浆DNA分子中的多个CpG位点来进一步区分癌症患者和非癌症患者，“开启了基于长cfDNA的癌症诊断的新可能性”。

然而，一些研究人员认为仍然需要更多的数据来更好地了解这些长cfDNA分子的生物相关性。南加州大学研究人员Bodour Salhia说：“我确实认为，在了解样本输入以及他们从这些研究中到底捕捉到了什么方面，还需要做很多工作。”

他研究cfDNA甲基化已有近十年。

尽管长读测序技术在剖析cfDNA甲基化方面蓬勃发展，Salhia（他的实验室一直在使用Illumina亚硫酸氢盐测序）还没有看到基于长读测序的方法与短读方法相比有强大的优势。

“看到研究DNA甲基化的新方法出现是令人兴奋的，因为它是那些总是落后于基因组学的领域之一，但我认为使用短读数的亚硫酸氢盐测序仍然是完全可以接受的，而且确实能很好地捕捉到样本的复杂性。”

特别是考虑到cfDNA的自然大小分布，其长度往往聚集在160bp左右，短读数测序是使用的“适当”技术。

然而，Salhia认为基于长线的方法的无双硫酸盐和无PCR性质是有优势的。

“我现在看到的长读测序的一个真正的优势是，如果它真的能起作用，它可能是一个简化的工作流程，但我不认为它比现在的普通短读测序更好或更优。”

斯坦福大学生物工程教授、陈扎克伯格计划科学负责人Stephen Quake在评论新兴的基于长读测序的方法时指出：“很高兴看到有其他方法来读取[cfDNA]甲基化；该领域一直需要新的方法。”

Quake的实验室也一直在使用Illumina测序技术研究cfDNA甲基化，他说基于长读的研究在学术上提出了有趣的数据，但他指出：“现在知道这些方法将如何转化或是否会转化用于临床还有点太早。”

同时，基于短读测序的cfDNA甲基化检测似乎已经在临床诊断领域占据了先机，这体现在Grail公司2021年推出的Galleri，这是一种泛癌症液体活检测定，能识别血液中cfDNA的异常甲基化模式，以实现多癌症早期检测。

除了现已成为Illumina公司一部分的Grail公司外，其他大量的公司，如维也纳大学的HealthBioCare公司和加州Redwood City的Guardant Health公司，也在开发利用cfDNA甲基化信号的早期癌症检测诊断试验。

Salhia说：“这个领域在过去几年里起飞，主要是因为Grail，他们选择了甲基化而不是其他基因组学方法，这是该领域的一个转折点。”

在成本方面，尽管Salhia说全基因组亚硫酸氢盐测序仍然“有点成本过高”，但她认为使用短读测序的定向甲基化检测方法，如Grail公司采用的小组测试策略，“成本效益很高”。

然而，Quake是Bluestar Genomics公司的联合创始人，该公司正在开发基于羟甲基化的液体活检检测方法用于癌症检测，他说他不太确定从长远来看，测量目标cfDNA甲基化特征或整个甲基组用于诊断在财务上有多大的实用性，因为基因组中有如此多的甲基化。

相反，他认为羟甲基化表明了活跃的基因调控，有可能成为一种更具成本效益的表观遗传信号，用来开发cfDNA甲基化测定。

他解释说：“当你测量羟甲基化时，你不是在测量开启的基因，也不是在测量关闭的基因，你是在测量处于开启过程中的基因，羟甲基化真正捕捉到了关于肿瘤的一些有趣的动态情况。”

因为在任何时间点上只有一部分基因组是羟甲基化的，Quake推断该信号对于降低基于甲基化的液体活检测试的成本是有用的。

“如果你能只看羟甲基化的DNA，测序成本就会大大降低，而且你可以做一个全球无偏见的测量，而不需要做一个小组，但以一种非常实用和具有成本效益的方式来做。”

斯坦福大学的Lau说：“在这个领域有多个参赛者总是好的，因为第一，它可能是友好的竞争，第二，因为它推进了这个领域的发展。”