British Journal of Cancer丨前列腺癌血基液体活检：临床机遇和挑战

在英国，前列腺癌是男性最常见的癌症，每年诊断约48500例。每年有11855人死于前列腺癌，这是一个重大的医疗和经济负担。前列腺癌是一种异质性疾病，其特点是临床结果的高度可变性。因此，临床上迫切需要使用新的工具来实现更好的筛查方案，改善临床决策点的风险分层，并选择最有效的治疗方法，最大限度地提高治愈率和延长预期寿命，同时将患者的生活质量改变降到最低。

液体活检是一种功能强大的微创工具，可实时检测多种癌症类型的临床可操作畸变。然而，关于如何最好地筛查PC（前列腺癌）、改善风险分层以及最终如何治疗晚期疾病尚不清楚。因此，迫切需要开发更好的生物标记物来帮助指导肿瘤学家在这些环境中的决策。循环肿瘤细胞（CTC）、外泌体和无细胞DNA/RNA（cfDNA/cfRNA）分析，包括表观遗传学特征，如甲基化，都显示出在预测、治疗反应评估和检测新出现的耐药机制方面的潜力。然而，在常规临床实践中实施液体活检之前，仍然需要克服一些挑战，例如血液采集和储存、CTC分离和富集的成本、循环肿瘤含量低是基因组分析的一个限制，以及如何更好地解释生成的测序数据。

近日，来自英国的研究团队在杂志British Journal of Cancer上发表了一篇题为“Blood-based liquid biopsies for prostate cancer: clinical opportunities and challenges”的综述文章，在这篇综述中，研究团队概述了通过基于血液的液体活检管理PC的最新临床机会，以及在个性化治疗指导中实施PC的下一步。

图片来源：British Journal of Cancer

实体癌的分子分析已用于多种癌症类型，以确定预后较差的癌症并指导治疗选择。大多数研究都利用了对原发性肿瘤或转移性病变活检的DNA和/或RNA和/或蛋白质分析。这种方法有一些主要局限性。首先，从难以获得的转移瘤中获取组织存在实际和临床挑战。尤其是前列腺癌，因为高达90%的患者有骨转移。其次，由于空间或时间的差异，患者内部和肿瘤异质性可能导至遗漏或错误分类的癌症。第三，重复肿瘤活检以监测肿瘤演变和对药物的治疗反应动态是不可行的。

由于这些局限性，人们对基于血液的生物标记物（通常称为液体活检）产生了兴趣，作为固体肿瘤活检和成像研究的替代或配套研究，以更好地描述肿瘤分子驱动和治疗反应。DNA或RNA等核酸以及蛋白质、细胞和囊泡在人体血液中自由循环，可以使用各种分子技术进行分离（图1）。循环无细胞DNA（ccfDNA）可能是目前研究最多的循环分子，首次临床应用于产前诊断以检测先天性疾病。肿瘤衍生的ccfDNA也称为循环肿瘤DNA（ctDNA）。ctDNA在ccfDNA中的占比取决于疾病背景和肿瘤扩散，在诊断和/或局部疾病患者中可以在1%或以下，在去势抵抗前列腺癌的进展性转移患者中可以高达90%。完整的肿瘤细胞，被肿瘤释放到血液中，也可以被分离出来，在血液中被称为循环肿瘤细胞（CTC）。与白细胞相比，CTC的丰度非常低（在转移患者中约低于10个细胞/毫升血液）。这使得它们的检测和分离非常有挑战性。

前列腺癌的液体活检。图片来源：British Journal of Cancer

为了最大限度地提高从液体活检获得的分子信息的可靠性，需要为分析前步骤制定一个标准化的工作流程。

对于cfDNA分析，关键的分析前目标之一是避免裂解白细胞释放基因组DNA：这种DNA会稀释已经很少的肿瘤来源DNA，并可能导至假阴性结果。为了防止这种情况，在EDTA-K3管中采集的血液必须在静脉穿刺后2小时内处理。为了使临床实施具有更大的灵活性，已经开发出含有固定剂的采血管。这些旨在防止细胞膜溶解，可在采血后7天或更长时间内处理。这些试管现在被广泛使用，尽管其中一些含有类甲醛的化学物质，会导至交联和化学修饰，可能会干扰DNA扩增和下游评估，如甲基化率。

另一个重要的分析前目标是实现200 bp以下ccfDNA片段的最高提取效率，因为该范围包含大多数ctDNA片段。不同的研究测试了几种提取方法，表明根据所用试剂盒分离的短ccfDNA百分比不同。

对于CTC分析，应考虑不同的分析前步骤。首先，对于血液采集，需要使用防腐剂来避免细胞溶解。以细胞活力为目标的新方法能够在储存6天后维持活细胞。其次，从CTC中分离和扩增核酸仍然是一个挑战，不同的方法在识别遗传变异时容易出错。

细胞外囊泡（EV）的收集是一个特殊的挑战，因为静脉穿刺后血细胞（尤其是血小板）中的囊泡释放需要最小化，以避免纯度降低。然而，到目前为止，还没有商业上可用的特定EV防腐剂。广泛使用的分离方法，如超速离心法，无法区分EV的不同亚群（外泌体、微囊），其他方法，如免疫亲和法（Miltenyi®），针对不同的蛋白质（CD81、CD63），能够分离EV，但价格昂贵。目前，尚未就哪种方法可以获得更高的质量收率达成共识。

转移性前列腺癌患者的基因组ctDNA分析能够识别前列腺癌的基因组特征。诸如数字液滴PCR（ddPCR）和类似的靶向方法等技术已被广泛使用，并且可以以非常高的灵敏度（0.001%）捕获突变等位基因。然而，下一代测序技术（NGS）的发展使癌症的分子表征得以以合理的成本实现。包括全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）或靶向测序的可能性。全基因组文库可以通过两种方法富集以分析特定的DNA靶点：基于扩增子的方法或基于杂交的方法。这些靶向方法可检测血液中的前列腺癌突变，并用于临床验证试验，如UW Oncoplex和Foundation Liquid CDx试验。

检测突变的总体灵敏度取决于ccfDNA的肿瘤含量（TC）。与其他癌症类型相比，前列腺癌的主要特征是复发性拷贝数变化，而不是复发性突变。因此，利用泛基因组或复发性拷贝数改变的方法最适合推导ctDNA是否存在以及可能的丰度。迄今为止报道的大多数方法的灵敏度下限为5-10%，在大多数进展性转移性疾病患者中检测肿瘤，但在低容量转移性疾病患者中可能不够敏感。在前列腺癌中，检测ctDNA可以预测预后，并且随着治疗的进行，ctDNA的变化与治疗的不同结果相关。

总之，虽然ctDNA基因组分析现在已在临床管理中实施，并将越来越多地被医生使用，但当前分析的技术改进以及与其他数据的结合将提高结果的精确度，并且可以应用于患者群体的液体活组织检查。

表观遗传学变化包括与基因组功能相关的变化，这些变化不涉及DNA序列的改变。它们主要参与基因表达修饰。cfDNA的最广泛的表观遗传学特征是CpG位点的5-甲基胞嘧啶（5mC），该位点倾向于聚集在基因启动子区的CpG岛上，并广泛参与基因沉默。

ctDNA 甲基化标记物必须确保高克隆性、低个体间变异性以及肿瘤和组织特异性。全基因组甲基化变化发生在前列腺癌的发生、发展和转移过程中。这些发生在大基因组区域的复发性和大量事件可以被用来解决前列腺癌基因组检测的一些局限性，例如肿瘤含量低。大规模研究已经确立了这样一种范式：与全基因组或靶向测序等基因组方法相比，ctDNA甲基化分析具有更高的癌症检测灵敏度和组织起源特异性。

有许多复发性DNA甲基化改变，如GSTP1、APC、RASSF1A对前列腺癌具有潜在的转录组学或生理学影响。高甲基化GSTP1是前列腺癌中研究最充分的基因，是最早和最常见的事件之一。组织中GSTP1高甲基化对局部疾病有预后。在血液中，几项使用GSTP1检测作为血液中前列腺肿瘤替代物的研究发现，这对复发患者具有预后作用使用基于甲基化阵列的方法对多种组织特异性甲基化标记物进行分析表明，ctDNA可以预测接受治疗的转移性前列腺癌患者的治疗反应。

cfDNA的另一个潜在信息分子特征是DNA片段长度。cfDNA的片段长度分布通常在167bp处达到峰值，携带核小体定位信息，可用于衍生起源组织。

此外，与核小体occupancy相关的全基因组血浆DNA覆盖率的可变性可用于推断基因表达模式：可以根据转录因子可及性模式和核小体定位来区分癌症组织类型，这两种模式都是组织特异性的，并且在健康个体和癌症个体之间有所不同。这种方法还可以实时识别调节通路的重新编程，例如，AR依赖性前列腺癌向具有不同激活调节通路的AR非依赖性“神经内分泌”亚型的转变。

ctDNA（来源于肿瘤）的片段长度比相关的非肿瘤ccfDNA短。因此，片段大小选择可以富集ctDNA，提高在低肿瘤占比下对基因组改变和肿瘤特异性特征的检测。

血液中检测到的CTC数量与前列腺癌和其他癌症的治疗结果和总生存率相关。CellSearch®已被FDA批准预测晚期癌症患者。它使用了一种基于免疫磁珠的方法，靶向存在于腺癌分化程度最高的CTC表面的EpCAM（上皮细胞粘附分子）。从前列腺癌患者分离的CTC可以表达PSA，并显示前列腺癌的分子特征，如AR拷贝数增加、PTEN丢失和TMPRSS2-ETS基因融合。

微流控技术可以增强基于亲和力的捕获，并可以捕获与EpCAM无关的CTC。诸如大小或可变形性等机械特征也被用于将较大的CTC与其他血细胞分离。后者的优点包括活细胞可用于下游分析，如CTC培养。

细胞外囊泡（EV）是由脂质双层分隔的颗粒，包含DNA、RNA或蛋白质，由正常细胞和肿瘤细胞自然释放。外泌体是最常见的研究对象，由40-100nm大小的颗粒组成，在细胞间通讯中发挥重要作用，可能促进肿瘤进展和转移。一些研究已经报道了其作为诊断/预后标志物的潜在作用。例如，从外泌体分离的长非编码RNA序列（lncRNAs）的表达水平显示了将PC与健康供体区分开来的能力。

PSA检测不适合人群筛查，因为其对前列腺癌的特异性较低，导至大量过度治疗和误诊。

GRAIL Inc（Galleri®）在癌症筛查领域做出了重大努力之一。在他们的循环无细胞基因组图谱（CCGA）研究中，发现并验证了一种基于泛癌甲基化的靶向分析。训练集和验证集的结果是一致的，假阳性率低于1%，从第一阶段（18%）到第四阶段（93%）对癌症检测的总体敏感性增加。前列腺癌的临床评估很可能需要实施前列腺ctDNA筛查测试，因为前列腺癌既受到机会性前列腺特异性抗原筛查的干扰，也受到广泛变化的疾病过程的干扰。

在许多肿瘤类型的初步治疗后，ctDNA已显示出检测临床相关的微小残留疾病的证据。对多种癌症类型的研究一致表明，术后不久可检测到ctDNA的个体比ctDNA阴性的个体复发更快大约15%的局限性前列腺癌患者在治疗后最终复发。然而，这通常是通过PSA升高检测到的，基于ctDNA的检测必须提高PSA检测微小残留或早期复发疾病的性能。

液体活检在肿瘤体积和循环肿瘤占比更多的晚期转移性疾病中的作用更为明确。此外，选择患者进行靶向治疗的临床需求遵循了药物开发途径，目前的适应症侧重于复发患者。一些公司已经开发了多基因靶向捕获NGS分析，用于cfDNA分析，SNV、INDEL和拷贝数改变（CNA），以检测低等位基因频率下的一系列基因组畸变，主要是提供肿瘤突变谱（包括与前列腺癌相关的几个基因）。与前列腺癌更相关的是，最近FDA批准了一项液体活检测试，用于选择DNA损伤修复基因发生改变的患者，例如，FoundationOne®Liquid CDx，该测试是作为PARP抑制剂rucaparib和olaparib在转移性去势抵抗患者（以及其他癌症类型）中的辅助诊断而开发的。这个基于杂交的NGS panel捕获300个基因，包括BRCA1和2的突变。

除了选择患者外，液体活检还具有实时跟踪治疗反应和早期检测进展的潜力。例如，在对高负担复发转移性前列腺癌患者的研究中，CTC计数和血清乳酸脱氢酶是生存率的替代物，并评价ARSI治疗的效果。另一项研究探讨了在五个三期临床试验中登记的6000多名mCRPC患者在不同终点的CTCs动力学，并显示其与PSA反应相比的优势。在一项关于abiraterone与enzalutamide在mCRPC中的交叉研究中，基线ctDNA分数大于2%的患者与PSA进展时间缩短有关。在对ARSI有反应的患者中，在对治疗有反应时采集的样本的ctDNA比基线样本低得多。

适用于前列腺癌患者临床实践的液体活检分析应实现三个主要目标：

（i）分析验证，即测试的可靠性、测量准确性和再现性（包括样品的分析前评估和实验室间的一致性），

（ii）与适当设计的临床试验中要解决的具有临床意义的生物学问题有关的临床资格（通常首先在先前研究中收集的样本中进行回顾性测试，然后在液体活检测试是预定义目标的研究中进行分析）

（iii）定义临床效用和临床实施，这表明使用该测试可以改善临床结果，具有成本效益，并且可以实施。

总的来说，良好的前列腺癌血液检测应指导一个或多个临床决策点，如早期诊断、分子特征和风险分层、早期复发检测、治疗停止或强化以及识别转移环境中当前治疗的耐药机制。

在未来几年内，与临床医生、研究人员和生物信息学家合作解决这些挑战，将有助于了解谁和何时应该对某人进行分子分析，如何设计更好的生物标记物驱动的临床试验，克服技术挑战，并最终在前列腺癌患者的临床常规实践中引入液体活检。