胡总专栏 | 关于封闭液

最早的有关封闭的概念来源于免疫组化，1941年Albert Coons发表文章，采用一种封闭液可以消除抗体的非特异性结合。

原来，在免疫组化染色的过程中，发现有一些内源性的生物素，酶等非特异性物质干扰信号和增加背景，必须进行阻断才能达到好的效果，这里有几个英文词来形容它的功能（blocking或quench）。

所谓的好的视觉效果就是指高的信噪比（S/N），也就是降低背景信号。常用的封闭液一般有正常血清，脱脂奶粉，BSA，明胶等。

进入分子生物学时代，出现了好几个BLOT实验，如western blot，northern blot 和southern blot，还有一个dot blot。在这些实验中，无一例外地要使用到封闭液。

1984年，David. A Johnson给它命名为Blotto，起先我还认为这个词是根据blot起的商品名，后来查了一下原文，才知道是一个很有意义的缩写，叫做 (Bovine Lacto Transfer Technique Optimizer)

这是一种不含有表面活性剂的封闭液，在western blot实验中防止非特异性结合的效果比BSA和明胶要好，可以显著降低检测的背景。

后来，许多公司都开发了自己的独特封闭液的配方，并且商业化。目前市场上有很多商业化的封闭剂产品。

封闭剂的主要功能可以归类为，

1. 增强信噪比，

2. 降低非特异性结合，

3. 减少背景干扰，

4. 稳定蛋白增加灵敏度。

同时，还必须具备以下特征：

1. 有效地阻断检测物质与载体表面的非特异性结合；

2. 不会阻碍试剂的包被；

3. 具有稳定固相结合的功能（防止变性）；

4. 没有酶的活性导至检测信号的改变或者反应物的降解；

5. 每一批次的高度稳定。
   

从封闭剂的种类上来讲，可以将封闭剂分为以下几种：

1) 脱脂奶粉

首先是便宜易得，一般2.5-5% 浓度可用.但是，牛奶中含有一些磷酸化蛋白，因此，对于抗磷酸化的抗体不建议使用。

脱脂牛奶在western blot中是一种极为常见的封闭剂，效果相当的好。以前每次到北美回来时，总不免带几公斤奶粉回来。和婴儿无关，只是封闭！

2)小牛血清白蛋白

和脱脂牛奶一样，小牛血清白蛋白也是一种很常见的封闭剂。BSA 一般配成浓度2-5%使用. 但是价格比较贵。

3) 明胶

明胶是胶原蛋白的水解产物，就是一种短链的胶原蛋白，冷水鱼皮中提取的的明胶在低温下可以很好地保持液态，稀释到 0.1-5%用于封闭。

与BSA或脱脂奶粉不同的是，明胶不含有血清成分，因此不会与哺乳动物的抗体发生交叉反应产生背景信号。

但是，明胶不太适合用于生物素放大系统的检测，因为明胶含有内源性的生物素，对检测信号会产生干扰。很怀念Sigma的棕色大瓶1000ml液体明胶！记得货号是G7765。泪奔了。

4) 正常血清 (如：胎牛，家兔，山羊血清等。)

所谓的正常，就是动物无疾病，没有经过免疫如疫苗等，全血清中含有大量蛋白，可以用于封闭，但是一般情况下我们用的很少，

因为，它的封闭效果与BSA和脱脂奶粉相比，没有什么优势，而且血清也很贵，需要封闭的浓度也很高(~5-10%)。正常血清中含有大量的免疫球蛋白，会和哺乳类动物的抗体发生交叉反应。

5) 纯化的酪蛋白

酪蛋白是从牛奶中提取的蛋白质，是一种很老的封闭剂。著名的casein block现在还在广泛使用。必须知道casein就是一种磷酸化蛋白，因此不能用于磷酸化的检测。

单纯的酪蛋白不太好溶解，一般都是以钠盐的形式使用。溶解后的溶液呈半透明状态，好多人以为是污染后的浑浊，其实这只是一种错觉而已。

6) 非蛋白类封闭剂

Polyvinylpyrrolidone (PVP)是一种非蛋白类的水溶性聚合物，也是一种常用的封闭剂。可以结合NC膜或PVDF膜，与其它封闭剂联合使用，起到封闭作用。

尤其对于小分子的检测，大分子量的封闭剂的空间位阻，会影响小分子的结合。像PVP这样的封闭剂有很多，比如PVA，S7，S9等表面活性剂。

尤其是在侧向层析产品中，应用相当广泛。非蛋白类的封闭剂还包括糖类，蔗糖以及PEG也是一种很好的封闭剂，除了具有良好的封闭效果，还会起到稳定蛋白的作用。

7）吐温系列

谈了这么长时间的封闭液，居然没有提到吐温。有点不应该。虽然它也属于非蛋白类封闭剂，属于聚合物，属于表活，但是，作为封闭剂，必须单独拿出来讲。

吐温在封闭剂当中，我觉得称得起茶中大红袍，酒中的拉菲。我们常用的PBST和TBST，后面那个大写的T就是吐温：Tween。

它真实的名字叫做Polysorbate Sorbitan ，中文叫做聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，根据结构不同分为Tween-20，60，40，80等。

吐温的作用很强大，可以加在裂解液里溶解膜蛋白，可以加在结合液里用于稳定蛋白，可以和BSA混合作为封闭液，关键的吐温本身没什么毒性，还可以作为食品添加剂。

每个学免疫的人，对于封闭的理解，基本上都是从Tween-20和BSA开始启蒙的。

8) 商业化封闭液

一般情况下这些封闭液都含有一些神秘的蛋白和配方，再起一个响亮的名字：如SuperBlock。

可以推测其中不含磷酸化蛋白，不含有免疫球蛋白，不含白蛋白和生物素。还有一个特点就是封闭速度很快，让你可以缩短实验的时间。缺点就是很贵，一分钱一分货。

既然话题是封闭液，不能单说封闭剂，还得谈谈溶液的部分。选择什么样的溶液？要根据自己的检测要求来定。

最常见的是PBS或TBS，还有一些buffer比如碳酸盐，硼酸盐，都是碱性的缓冲液，醋酸盐buffer属于酸性的。

记住如果检测磷酸化蛋白，或用于碱性磷酸酶系统，不要用PBS。具体的使用还得在实战中进行摸索。

还有一类特殊的封闭剂属于特殊的有针对性的的封闭，最著名的就是HAMA。

免疫分析中出现问题的一个常见原因是干扰性抗体，如众所周知的人抗鼠抗体（Human anti-mouse Antibodies，HAMA）、一般的抗动物抗体、嗜异性抗体（Id）或类风湿因子（rheumatoid factors，RF）。