第四话 免疫相关概念

上一话介绍了什么是免疫层析法，解释了层析的定义，这一话来聊聊免疫的相关概念。由于“学的都忘，会的不精”，在众多学术和原料大佬面前，不敢班门弄斧，仅从研发下游调试角度出发，梳理一下相关的概念。

第一部分：抗原

抗原：能够诱导产生抗体（免疫原性）并且和这个抗体特异性结合（抗原性）的物质，一般是外来的大分子物质，参与免疫反应的结构域叫做抗原决定簇。

激活免疫反应并制备抗体是抗原的一个基本用途，可以说上三天三夜，不过这个我不会。所以让我们从临床检测上说起：

临床上我们检测的抗原有两类，一类是外来的，能够刺激人体免疫系统产生抗体，对人来说就是标准意义的抗原，比如细菌或病毒；另一类是人体内本身存在，一般不能刺激人产生抗体，但我们通过用这些标志物免疫动物获得抗体来进行检测，所以也归为抗原类，比如HCG、cTnI。

检测细菌抗原：可以针对其外在结构蛋白，如细菌外壳、鞭毛等，也可以检测其分泌的特殊蛋白，如尿素酶、细菌毒素等，这些可以直接检测相应抗原。如果需要检测细菌内部非分泌性蛋白，就需要先裂解。

检测病毒抗原：很多病毒结构简单，突变频率高，而且往往是表面结构发生变化以利于侵染细胞，所以一般检测相对保守的核心蛋白，以期覆盖不同毒株，比如甲乙流和新冠，所以测病毒往往都需要先裂解，释放其核心蛋白抗原。

检测内在标志物抗原：首先要明确检测的是什么，比如HCG，有测α+β完全分子的，有测β亚基的，β亚基又分为总的和游离的，针对不同的检测目标物，去寻找对应的抗体。

抗原类检测指标都是明确的标志物，就是在特定状态下出现或升高，正常状态下消失或降低的东西。比如正常人本身不含病毒，测出来病毒抗原就代表感染了，是现症感染（正在感染过程中）的标志物，把病毒消灭了也就测不出来了；再比如HCG在女性体内本身存在，但在孕期明显升高，生完孩子又回复到正常水平了，所以HCG就是怀孕的标志物。

除了是检测的目标外，抗原也会用在产品的生产过程中，比如要测抗体的时候，可以通过两个抗原夹心，或者抗原+抗抗体的间接法来实现，这个在后面免疫层析检测模式中会详细介绍。

抗原还有一个重要的用途是用于产品质控：从来源上可以分为天然抗原和重组抗原。

天然抗原是天然存在的，通过纯化（有的需要先裂解）天然的东西而获得。优点是他就是你要测的东西，具有各种线性表位和空间构象表位，加到样本基质中就可以当样本了，可以用于评估不同厂家（不同抗体）的产品。缺点是不一定能找到，产量少往往价格贵，并且一般都容易降解。

重组抗原的话，是基因工程表达的一个蛋白片段，一般都不可能做到天然抗原那样，可能只含有一个或某几个天然抗原中的特异表位，可以用于制备抗体，也可以用于配对抗体的工艺调试，优点就是与天然抗原那些缺点相反的点，缺点也一样相反，他可能跟你要测的目标物差异很大，比如空间结构、位点丰度等，所以测重组抗原仅适合质控配套的抗体。用不同来源（不同重组抗原免疫）的抗体测同一个重组抗原的结果，跟测天然抗原的结果可能完全不相关。

半抗原：是只有抗原性，而不能诱导免疫系统产生抗体的物质。一般是小分子物质，由于体积太小，只有一个抗原表位，被B细胞识别结合后，露不出头，没法结合T细胞表位，也就无法激活细胞免疫，不能产生抗体。但是我们可以通过偶联载体蛋白如BSA、OVA等来给他增肥，就能激活细胞免疫制备抗体。小分子只有一个抗原决定簇，偶联后免疫出来的大部分抗体都是识别载体蛋白的，因为载体蛋白对于免疫的动物来说也是外来抗原，之后再通过筛选来挑出特异性针对小分子抗原的抗体。下游应用时也一样，包被和标记也都需要借助载体蛋白来实现。

第二部分：抗体

抗体：与抗原特异性结合的免疫球蛋白，就好比一把钥匙开一把锁，钥匙的形状是根据锁芯设计的，而抗体的Fab端就是免疫系统根据特殊的抗原决定簇设计的。抗体主要有五类，临床上检测的主要是IgG和IgM型，IgM在初次感染的早期产生，因此检测到IgM或者抗原都能判断是现症感染。之后IgM会逐渐减少消失，慢慢出现IgG并维持一定的滴度，检测到IgG不能确定是否正在感染病毒，可能是既往感染留下的，有些IgG滴度终生不减，也可能是打了疫苗产生的。

之前有群友问抗体滴度和浓度的关系，可以这样理解，两者都表示抗体数量，不同点在于:浓度是国际单位的精确计数，只看单位体积内的数量（重量），比较单纯。滴度是达到阳性结果所需抗体的大概计数，是自定义单位，并且是通过稀释得来的一个比值，有临床目的性。

举个例子，浓度是一个方阵内有多少个士兵，是精确数出来的。浓度之间有可比性，无论谁来数，浓度高就是代表方阵内士兵多。    滴度是把士兵方阵一半一半的分割，能抓住一伙盗贼的最大分割次数就是滴度，一方面跟士兵本身的数量有关，士兵数量越多，能分割的次数自然就越多。另一方面跟士兵和盗贼的战斗力也有关，用不同战斗力的盗贼去测试，能分割的次数不一样，而同样的士兵数量，士兵战斗力不同，能分割的次数也不一样。

所以滴度是当时特定的临床检测方法衍生出来的术语，近似于效价。一般临床上测抗体很难得到精确的浓度单位，因为个体免疫差异和所用抗原问题，无法检测全部的抗体，只是测一部分针对特定抗原决定簇的，定性测个有或无就可以了。

理论上说抗体对人有保护作用，能识别并帮助清除病原体，能免受再次感染，比如麻疹、天花等接种了疫苗可以终生保护。但是，有抗体也不一定能阻止感染，可能滴度不够，也可能病毒特殊，比如感冒病毒容易变异，比如HIV能逃避免疫攻击。还有很多抗体是打酱油的配角，随便抗点啥的，比如分泌蛋白之类的。

研发常用的抗体主要是IgG，我们再来看一下IgG抗体的结构图：

一个IgG的分子量大概是150KD，长度大概是8nm左右，由两个25KD左右的轻链和两个50KD左右的重链通过二硫键结合在一起，呈Y字形，头上氨基端是两个结构一样的可变区Fab，是特异性结合抗原的地方，也就是上面说的针对某个锁的钥匙部分。底部羧基端Fc是相对恒定的部分，相当于钥匙链，不同的钥匙上可以挂一样的钥匙链。同一种抗体，比如鼠抗人HCG的IgG型抗体，和鼠抗人cTnI的IgG型抗体，其Fc基本一样，这里可以结合二抗、SPA等。注意这里面写的数字都是大概，实际会在附近波动，不同抗体可能差别很大。

抗体比较常见的几个参数：浓度、纯度、效价。

浓度：是我们研发常见的单位，一般是通过紫外分光光度计测蛋白质特异吸收峰（OD280）来估算，可用于工艺控制，比如包被浓度1mg/ml，信号弱了，就提高到1.5试试，如果强了就降到0.5看看，水多了加面，面多了加水就好了。

效价：类似滴度的概念，是把这个抗体稀释多少倍还能跟抗原有阳性反应的这样一个比例，比如1:64000，就是这支抗体稀释64000倍还能反应，能稀释的倍数越大，抗体效价越高，说明活性越“强”。这是一个间接的活性指标，是原料厂家用特定的抗原得来的试验结果，前面重组抗原那里如果明白了，那也就明白了A的1；32000并不比B的1:128000活性差，这个指标的意义其实不大，现在原料厂家都很少提供这个信息了，自己也没必要测试。

纯度：一般是测电泳看有没有杂带，分为还原性（打开二硫键）电泳和非还原性（不打开二硫键）电泳。通过上面结构图可以得到推论，非还原性电泳会在150KD左右出现一个条带，而打开二硫键的还原性电泳，则会在25KD左右（轻链）和50KD左右（重链）的位置出现两条带。如果没有杂带，就说明抗体纯度够高。

对于外购原料，一般我们直接用就可以了，纯度、浓度、效价这些辅助指标厂家都有出厂质控，我们不测也可以，一切以性能实验为准。当然，出于合规目的，进厂检验有条件还是可以测一下的，测不了起码也要有这方面的COA。

单抗：是针对相同抗原决定簇的，由单一B细胞分泌的单一亚型的抗体。亚型是根据Fc端二硫键的位置和数量分的，有IgG1、2a、2b等，亚型不是人为控制的，生出来啥是啥。

多抗：是针对同一免疫原（一个或多个抗原决定簇）的不同“单抗”的混合体。因为是直接打腹水提纯的，受动物免疫功能影响，批间差一般都比单抗要大，而且不太好标记。

二抗：抗抗体，以抗体（通常只是Fc片段）免疫另一物种产生的一种抗体，也就是说，如果种属差异够大，某一种属的抗体，对另外的物种来说就是抗原。

有多抗如羊抗鼠IgG，这个在我入行那会新奇半天，又是羊、又是鼠，有抗、还有IgG，这名字咋这乱啊，他到底是个啥？首先得注意断句的方法：羊-抗-鼠IgG，是用鼠IgG的Fc片段免疫山羊，获得的一种能够结合鼠IgG的山羊多抗，不是只有羊IgG抗体，不要断在鼠和IgG中间。不管你小鼠单抗是针对什么抗原的（主要是Fab差异），其Fc基本是相同的，所以都能被羊抗鼠IgG结合，常用做C线，但是不同亚型的IgG的Fc段结构有差异，与二抗的结合效果可能存在区别。也有单抗如鼠抗人IgG、鼠抗人IgM，是最常用的间接法（捕获法）的原料，学会了前面的断句方法，这里也就不会混乱了，鼠-抗-人IgG和鼠-抗-人IgM，两者其实都是鼠IgG抗体，只不过分别结合人的IgG和IgM。

第三部分：抗原抗体的反应

抗体跟抗原特异性的结合，宏观上说是因为结构互补，就像钥匙是根据锁芯的形状配的一样，微观上是由几种作用力共同作用维持紧密结合，分别是：

1.电荷引力：由于抗原和抗体分子中特殊的带电基团，比如带正电的氨基和负电的羧基基团之间电荷相反，导至异性相吸，促进结合。这种引力和两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷越接近，静电引力越强。

2.范德华引力：本质上也是电荷引起的引力。由于抗原与抗体两个不同大分子外层轨道上电子之间相互作用，使得两者电子云中的偶极摆而产生吸引力，促使抗原抗体相互结合。能量比静电引力弱一些。

3.氢键结合力：由分子中的氢原子和电负性大的原子如氮、氧等相互吸引而形成的。氢键比电荷引力更具有特异性，因为它需要有供氢体和受氢体才能实现氢键结合，而电荷引力只要满足异性相吸就可实现。

4.疏水作用：抗原抗体分子侧链上的非极性氨基酸（如亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸）在水溶液中与水分子间不形成氢键。当抗原表位与抗体Fab靠近时，相互间正、负极性消失，失去亲水层，疏水基团会排斥中间的水分子而相互靠近结合。疏水结合对于抗原抗体的结合是很重要的，提供的作用力最大。

最后再介绍一下蛋白等电点PI：

蛋白质是一种两性电解质，既可以从羧基释放H+，从而带负电，也可以让氨基结合H+而带正电，到底带什么电荷取决于所处Ph环境，在某一Ph下，蛋白整体电荷为0（正负电荷数相等），对外不显电性，这个Ph就是蛋白的等电点PI；当环境Ph大于等电点时，整体带负电（负电荷基团多于正电荷）；环境Ph小于等电点时，整体带正电（正电荷总数多于负电荷）。如图所示：

虽然宏观上抗原抗体互补才能特异结合，但是通过微观描述我们会发现，只要满足作用力形成的条件就会发生结合，正所谓成也萧何败也萧何。所以我们在调试过程中会遇到各种假阳反应，比如抗体跟结构类似抗原的交叉反应，这个一般较少，但是发生了就很难消除，除非换抗体。另外还有很多抗体跟不相干抗原的非特异反应，甚至会发生抗体跟抗体的非特异结合，这个大部分是电荷作用力引起的，因为我们用的抗体和大部分抗原都是蛋白质，普遍存在带电基团，电性相反的基团一见面就手拉手了。偶尔也有疏水引起的假阳，尤其缺乏表面活性剂的情况下更容易发生，表面活性剂能减少疏水基团的暴露，可以减少疏水假阳的发生，但不是说有表面活性剂就没有疏水结合了。

从研发角度来说，比较关注的抗体原料的信息：首先是浓度，这是调试的一个控制参数。其次是种属来源，这涉及到C线的选择。再然后是抗体类型，IgG还是IgM，IgG是什么亚型的，是单抗还是多抗，这关系到标记和包被的选择策略，一般IgG₂型、IgM和多抗都不太好标记。抗体等电点，有没有信息无所谓，理论上有用，但是实际操作上不以PI为依据。

如果悲催的你被领导扔过来几个没有任何COA信息的抗体，就一个编号、一个浓度，也不用怕，经历几轮折磨人的实验也能大概判断出来这些参数，并且能认识的更深刻一点。这个行业就是这样，很多理论都是通过某些实验总结出来的，经验很重要，无论成功的还是失败的。

最后唠叨几句，为什么这么多篇幅介绍基础知识，其实这些知识网上都可以收集到，平时做实验，可能也用不到这些理论支持，跟着有经验的人照猫画虎，一步步就做出产品来了。但是实验不顺利的时候，或者想朝某一个方向优化的时候，我们要分析并解决问题，很多时候因为缺乏理论知识，会把显而易见的表象当作问题本身，不再进一步探究，这时候基础知识比较有指导意义，他不一定能立马告诉你该怎么做，但是可以帮助你排除一些原因，找到最终的问题所在和解决办法。

比如上一话讲的层析，如果液体层析到吸水纸与膜的交界处就不再往吸水纸跑了，显而易见的表象是吸水纸那里有问题，是不是搭接出了问题？如果搭接没问题，那会不会吸水纸吸水能力不够强，导至液体跑不上去？通过层析的原理，我们知道了为什么发生层析，是因为我们用的亲水组件都有毛细孔结构，他们可以发生层析，但也可以存水，只要液体的体积足够多，有多余的液体分子发生浸润作用，就会继续往上层析，即使没有吸水纸的存在，层析依然会发生，所以吸水纸并不影响层析的动力，如果液体跑不到吸水纸，一般是上样液体体积不足以支持继续层析了，而不是吸水纸吸力不够导至液体上不去。

如果液体能跑完，但是金子跑不完，那又是另一种情况，比如我们知道层析需要一定的表活，那就往表活方向调整，那如果表活足够多还不足以让背景干净呢？我们还知道层析过程金子和液体是在膜中一个一个的孔洞里往吸水纸方向爬的，最初的膜宣传时经常提到孔径6μm、8μm之类的，这个孔径的测量方式是沿着垂直层析方向进行的（这个指标更适合渗滤法参考，但其实也没多大用），就像过筛子一样，能透下去的粒子最大粒径就可以当作膜的孔径，后来膜为了提高韧性，多加塑料背衬生产使用，这种测量方式就不合适了，而且我们一般是做侧向层析，所以膜厂家慢慢都采用层析4cm用多少秒这个单位来划分膜的规格，比如140、90就是层析4cm用了140秒和90秒，这个跟孔径有关系，孔径大，层析4cm所需时间就短点，孔径越小，层析时间就长点，而膜的孔径是由于生产过程中气泡挥发而形成的，他并不是均匀，而且很有可能在侧向比垂直方向的孔径要小、更不规则（感兴趣的可以翻看一下上一话中NC膜的图片），如果金子在层析过程中发生了聚集，而且层析过程中的聚集往往越到后面聚的越严重，层析到狭窄的地方就过不去了，导至金子层析不完全，背景很难看。所以，这个层析不好的表象问题，最终会落到标记、反应体系甚至抗体选择的问题上。

还比如这一话讲的重组抗原，如果你开发一个项目，收到了甲的抗体和重组抗原，还有其他乙、丙、丁的抗体。甲的抗体正好是重组抗原A制备的，而乙的抗体是用结构完全不相干的重组抗原B制备的，那用A抗原去测两家抗体，甲自然就脱颖而出，而乙连反应都没有，当然就pass掉了。问题的表象是乙的抗体活性不行，甚至不配对。但你知道了重组抗原的缺点，那么问题就变成重组抗原A的适用性了。如果不巧的是，天然样本中B抗原的丰度更高，特异性更好，那么测实际样本时，乙的抗体明显会更好。当然这是一个极端的情况，丢西瓜捡芝麻的事，原料厂家不太会去做，大家都盯着好用的位点开发原料。但测重组抗原跟天然样本有较大差异的情况并不少见，所以筛原料的时候一定要以实际样本测试结果为准，再不济也得测天然抗原了。 

还有等电点，胶体金标记及标记后的稳定，缺少不了同性电荷相斥作用的维持（具体的说是负电荷），我们知道了Ph对蛋白电荷的影响，那就自然理解了为何标记Ph越低越容易死金，为何一般金标洗液和复溶液都倾向于用高Ph的缓冲液，以及产品调试过程中，高低Ph对反应信号的不同影响。这些到后面章节还会具体说一下。

下游研发工作，理论的研究虽然没法做，但是理论知识的储备和思考，是研发必不可少的。而且跟人讨论或者请教问题的时候，理论的思考能更好的打开话题。我入行那会就是照猫画虎的学，经常误把表象当问题，然后找不到解决的办法，想当然的把这当作一个不可改变的基础属性。后来突然对理论感兴趣了，开始各种搜寻理论知识，并有幸认识了涛哥，因为他的回帖经常说出一些让人信服的理论来，所以经常带着思考向他请教问题，涛哥可以很无私的跟你分享理论知识，指导你实验思路，但很少直接告诉你解决方案，除非这个理论之前已经聊的差不多了，他又比较忙的时候，可能直接丢给你一个配方。简单的伸手要配方，一个是容易让人提不起兴趣来回答，再一个不同原料有不同的脾气，针对同一个问题可能需要尝试不同的解决方法，没有啥是一定能通用的，但是理论的指导总归是八九不离十的。

当初在**里涛哥很活跃的解答问题，我那会刚好经常挂机存了好多聊天记录，就整理出来了《涛哥答疑录》分享在**里，也有人分享到其他群和论坛上，新入门的人可以去搜一下看看，里面有很多理论的探讨和一些问题的解决办法，对研发实验会很有帮助。说来也挺悲哀的，现在的**、微信群和论坛基本上都是广告推销，很少有讨论技术问题的了。

本话完。