核酸芯片的原理、分类及技术亟待解决的问题

2022-5-9 14:24| 编辑: 归去来兮| 查看: 1753| 评论: 0|来源: IVD分享库

摘要: 20世纪80年代中期俄罗斯恩格尔哈得分子生物学研究所在世界上最早提出以杂交法进行核酸序列测定的思路

20世纪80年代中期俄罗斯恩格尔哈得分子生物学研究所在世界上最早提出以杂交法进行核酸序列测定的思路（Sequence by hybridization, SBH）。当时使用的是八聚寡核苷酸探针。与此同时，英国牛津大学的Southern也取得了在固相载体上固定探针进行杂交测序的国际专利。核酸芯片由此而诞生。但是核酸芯片技术的真正兴起则应归功于Affymetrix公司始创的光引导原位化学合成技术，并由此而诞生的可用于全基因组分析的高密度和超高密度核酸芯片。

所谓核酸芯片（gene chip）也叫基因芯片、DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是指采用原位合成（in situ synthesis）技术或微量点样技术，将数以百计或者数以万计的DNA探针固定于固相支持物表面，从而产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品的快速、并行和高效的检测及分析。和传统的计算机芯片相同，核酸芯片技术的核心思想同样是集成化，并且在制作上借鉴了很多源于前者的成熟技术。核酸芯片技术的诞生与基因组和后基因组时代的需求相适应，以其本身所具有的革命性优势，作为一种强有力的分析工具，必将在生命科学、医学及其他相关学科中扮演重要角色。

一、核酸芯片的原理

核酸芯片是传统的核酸杂交技术与微加工技术以及化学中的合成技术相结合而产生的一个复合体。但是万变不离其宗，其原理仍然是基于碱基相互配对结合达到检测的目的。与传统的生物分析方法相同，核酸芯片的分析过程同样包括样品制备、生化反应以及结果检测三大步骤。

核酸芯片的制作

对于核酸芯片，可供选择的固相载体包括硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等。制作阵列时，先对固相载体做适当化学处理，然后采用光引导原位化学合成技术可以在固相载体的表面合成高密度寡核苷酸探针，或者将事先合成好的寡核苷酸探针或经纯化定量的PCR产物，按照预先设定的模式，由计算机控制的点样机器人准确、快速地点到载体表面，然后经过相应的化学处理即可获得可供使用的核酸芯片。在点样式芯片技术方面，必须提到的是斯坦福大学的Brown实验室，他们建立了一整套适合于小型实验室的核酸芯片操作规程（从点样仪的搭建、点样、固定、杂交到结果分析），并将之与国际学术界共享。

样品制备

一般实验室采用的是通过在PCR的过程中掺入荧光素来标记靶片段，达到对待测靶分子的标记作用。如果被分析样品是mRNA，则一般是在反转录的过程中引入荧光标记。

Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统，即桥式PCR。具体做法如下：首先针对样品中待检测的多个靶片段设计并合成引物，然后按照预先设定的模式固定到一个特定的固相载体表面，再通过一种桥式级联放大技术来同步扩增多个靶DNA分子，这种方法的最大优点是避免了PCR技术在临床应用时的最大难题一残留污染，同时避免多重扩增时不同扩增之间的相互竞争，这一技术的缺点是扩增效率不高。此外，Lynx Therapeutics公司也提出了一个革新方法，即大规模平行固相克隆（massively parallel solid-phase cloning）。这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆，且不必分离和单独处理每个克隆，使样品扩增更为快速，有效。

核酸杂交

对于不同的芯片类型和实验目的，样品与探针的杂交条件以及杂交后的清洗条件均不相同。对于寡核苷酸芯片，杂交条件需要严格加以控制，尤其是在做单点突变检测或者SNP检测时。一般的做法是在比探针的Tm值低5~12℃的条件下做预实验，然后在预实验的基础上进行调整。当探针数目较多时，如何使同一点阵中的多个探针在相同的温度和离子浓度下均能有效而特异的杂交是寡核苷酸芯片研究中的一个核心问题。因此，在寡核苷酸芯片中探针的设计显得尤为重要，除了要考虑统一Tm值之外，还需要鉴定探针的特异性，将交叉杂交的可能性降至最小。

对于cDNA微阵列，由于探针一般是变性的PCR产物，因此对杂交条件的控制要求不如寡核苷酸芯片高。对于用来做表达分析的寡核苷酸或cDNA微阵列芯片，在定量上要求较高，所以在实验中需要加入高、中、低三种拷贝的对照，而且定量的结果需要用传统的方法如Northern杂交或者定量PCR加以验证。

杂交结果的检测和分析

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