诊断技术｜分子诊断的重要性

在过去的25年里，分子生物学和生物技术的革命已经导至了健康和生命科学的重大变化，新的和/或更好的人类和动物的（传染性）疾病管理已经成为可能特别是这两年的疫情，更是让分子诊断技术实现了跨越式发展。

许多来自科学研究的方法和技术在病原体和肿瘤的分子诊断中，以及在发现人类、动物和植物的遗传性疾病中显示出了作用。技术已经变得更容易使用、更可靠、更快、更便宜，而且在大多数情况下，更加敏感和特异。

事实证明，质量控制和了解诊断结果意味着什么对检验科的管理至关重要。

高通量技术和自动化使得在很短的时间内分析大量的样本成为可能。强大的计算机和专门为此目的设计的生物信息学工具越来越多地被用于诊断中。

在过去几十年里，病人护理本身也发展得非常快，如今，在症状变得明显之前，就可以对糖尿病、心脏和凝血疾病、癌症和神经系统疾病等疾病（风险增加）进行早期预测。

在越来越多的情况下，对药物治疗和其他治疗方法的反应可以被准确监测并根据个人情况进行微调。对于检验科来说，这意味着必须快速提供足以影响治疗决定的结果，而且临床实验室将越来越多地参与到治疗决定中。

新技术不仅对病人护理具有重要意义，而且还可用于其他一些领域，例如：

• 犯罪调查，可以根据犯罪嫌疑人的基因特征来确定其身份；

• 分类学研究，通过序列分析和比较，可以建立进化关系，这样一来，在农业、植物和蔬菜等领域的物种识别将成为可能；

• 基于（国家间）法律的转基因生物（GMO）的控制。

基本的分子生物学研究真正加速了遗传物质的诊断分析，作为一种「衍生」，这门特殊的学科被称为分子诊断。

在过去的几十年里，技术已经变得更快、更敏感、更可靠。由于硬件的改进和对病原体以及DNA和（m）RNA水平的遗传缺陷的了解的增加，越来越多的传统方法，如细胞和组织培养，以及免疫化学正在被分子技术所取代。

原位杂交也是如此，这是一种分子技术，越来越多地被更快速和敏感的技术（如测序）所取代。护理点测试和「个性化医疗」将变得越来越普遍，并且已经在热带疾病管理等方面小规模地实施。

用一系列不同的技术分析核酸，是任何形式的分子诊断的基础。1970年代，Frederick Sanger（剑桥大学）和Walter Gilbert和Allan Maxam（哈佛大学）开发了确定DNA分子中碱基顺序的方法（DNA序列分析或测序）。

PCR技术是在20世纪80年代和90年代之间推出的。在过去的十五年里，传统的PCR在许多应用中被实时PCR取代，使PCR的应用更快、更敏感、更可靠、更大规模，而在同一时期，微阵列也在发展。

目前，在美国NCBI的网站上可以找到无数生物体的序列，每天都有新的序列被添加到数据库中。

研究人员可以使用这些序列进行注释，这意味着他们可以寻找一个有趣的序列的含义，寻找与疾病的任何关系或功能，或确定进化关系。同样，人们可以检查PCR和其他引物/探针相关技术的引物和/或探针的有用性和特异性。

由于人类基因组计划，人类基因组的大部分（序列）于2001年被揭示。在随后的十年里，所有的人类基因都被描述出来。

如今，重点是检测（人类）基因的偏差、甲基化、突变、关键基因的变化及其在恶性肿瘤或其他遗传性疾病中的表达，并通过更快、更敏感的序列分析设备确定病原体的基序。

对一个物种的基因组进行测序使人们有机会揭示微生物的各种毒力和抗生素抗性基因，并在不同物种、部落或种族的进化关系中寻找答案，因此，多个基因组项目的结果构成了大规模序列测定的前沿阵地。

对小鼠、大鼠、斑马鱼和豚鼠等动物基因组的了解支持了动物试验中的实验设计，对结果的解释，以及随之而来的对人类的推断。

下一代测序技术允许对基因或突变进行快速和大规模分析。这可能非常有帮助，不仅可以追踪参与肿瘤发展和进展的基因，如乳腺癌或结肠癌，还可以检测（肿瘤特异性）目标，如新疗法的扩增基因或（变异）受体。

例如，可以搜索导至HIV对某些药物产生抗性的突变。

2、分子诊断技术

分子诊断中最重要的三种技术是杂交、扩增和测序。

2.1、杂交

杂交是指DNA或RNA中的序列可以通过具有互补序列的探针来识别。

尽管讨论了所有的技术革新，杂交仍然是许多（创新）技术的基础。这不仅适用于PCR，其基本原理是引物和探针的杂交，也适用于（下一代）测序、微阵列技术和其他高通量技术。

2.2、扩增

核酸的扩增（增加）是聚合酶链反应（PCR）、其他扩增技术以及许多类型的测序的基本原理。

几乎无法想象，1985年才首次描述的PCR及其应用是如何早短短的三十年内飞速发展到今天的。

1988年，随着热稳定的Taq-DNA聚合酶的出现，PCR第一次获得了重要的发展势头。自1991年以来，实时PCR（或qPCR）已经发展成为一种可靠的方法，可以在一个「封闭系统」中分析、识别和量化核酸。

qPCR方法，减少了污染风险，预示着这种方法在检验科中进入了一个新的指数增长阶段。

与此同时，人们也意识到分析和识别错误是非常重要的，有关PCR技术的质量控制和质量要求正越来越多地被纳入企业管理当中。

2.3、测序

更快、更可靠的测序方法已经出现，可以以相对较低的成本确定核酸序列。下一代测序（NGS）技术已经取代了传统的基于Sanger的方法，现在正在探索其作为分子诊断工具的意义。

随着每兆字节核算检测的成本不断降低和检测设备的小型化，我们开始获得了越来越多的数据，为了能够对这些超大数量的测序碱基对和相应的数据进行处理，越来越多的生物信息学工具也被开发了出来。

图1|从2011年到2016年，兆字节（a）和基因组（b）的测序成本都有所下降。

为了解决许多科学和医学问题，分子诊断已经发展成为一门重要的学科。基因组的解开和新技术的出现将提供大量的数据。挑战将是如何管理这些大量的、有时是敏感的信息。生物信息学和强大的硬件/软件将变得至关重要。

另一个重要的关注点可能是诊断活动从专业实验室转移到普通医生和/或甚至消费者/病人本身。这些所谓的护理点测试（POC）必须经过校准和验证，以便由非技术人员使用。这对质量和安全方面提出了新的挑战，因为诊断测试需要满足质量要求，包括敏感性、特异性和安全性。

因此，监测这些测试的质量是非常重要的，而且还要监测对结果的正确解释。