Nature子刊！基于Cas12a的新冠RNA检测新方法，又快又好！

近几十年来，由严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、人类免疫缺陷病毒（HIV）、寨卡病毒和埃博拉病毒等病毒引起的流行病大规模暴发，以及当前的SARS-CoV-2（2019年冠状病毒病（COVID-19））大流行。到目前为止，世界在控制SARS-CoV-2传播方面面临着严峻的挑战。SARS-CoV-2已造成数百万人死亡和巨大的经济损失。SARS-CoV-2传播迅速，部分原因是症状前和无症状传播的高流行率。2019冠状病毒疾病的诊断是至关重要的，探索快速、特异和敏感的诊断策略。

然而，核酸诊断检测的可用性一直无法跟上快速传播的步伐，因为基于逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）的检测是SARS-CoV-2诊断的金标准，需要熟练的人员和设备基础设施，而且样本应答时间长。对无症状携带者进行足够敏感的定点核酸检测，并有足够快的周转时间，对于控制大流行至关重要。等温扩增分析，如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP），提供了快速、低成本的替代方法。Abbott’s ID NOW 2019冠状病毒检测试剂，利用等温扩增对未提取的样品进行检测，能够在13min内报告结果；然而，在RT-qPCR检测呈阳性的样本中，有三分之一至45%的检测结果为阴性。此外，等温扩增分析通常会进行非特异性扩增，导至假阳性结果。

CRISPR–Cas是由RNA引导的内切酶，用于切割特定的核酸序列，该过程称为顺式切割。在识别序列后，Cas12和Cas13表现出分别切割非目标单链（ss）DNA和ssRNA的副作用，这一过程被称为反式切割。通过Cas12或Cas13家族成员蛋白扩增靶序列和顺序顺式切割，然后反式切割笼状报告分子，产生基于Cas13a或Cas13b的SHERLOCK（特异性高灵敏度酶报告解锁）和基于Cas12a的DETECTR（DNA内切酶靶向CRISPR反式报告）。

SHERLOCK和DETECTR均已通过临床验证检测SARS-CoV-2。然而，除了RNA提取步骤外，这些方法还使用两步过程（扩增目标序列，然后进行CRISPR检测）。多个液体处理步骤增加了操作时间和交叉污染风险。SHERLOCK被进一步发展为STOPCovid.v1和SHINE来解决这个问题；在这些分析中，结合等温扩增和CRISPR检测一步法检测未提取的样品。STOPCovid.v1和SHINE的简单性使其在护理点测试中具有吸引力。然而，它们的灵敏度远低于RT–qPCR，总反应时间约为1h。使用Cas13a进行SARS-CoV-2无扩增检测的方法可在30分钟内获得检测结果，但其灵敏度至少比RT-qPCR低100倍。

来自我们中国武汉大学中南医院的研究团队在杂志NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING上发表了一篇题为“Fast and sensitive detection of SARS-CoV-2 RNA using suboptimal protospacer adjacent motifs  for Cas12a”的文章。在文章中，研究团队开发了一种基于Cas12a的方法，名为sPAMC，该测试具有更高的灵活性、速度、灵敏度和再现性。在一步CRISPR检测中，Cas12a的等温扩增和Cas12a的切割同时发生在同一试管中，使用CRISPR RNA（crRNAs）将底物与sPAM (suboptimal PAM) 结合，而不是常规使用的标准PAM，可以将反应速度加快2到3倍。此外，广泛的测试表明，sPAMC比使用规范PAMs的one-pot试验具有更高的敏感性和可靠性。sPAMC允许在10分钟内检测人类巨细胞病毒（HCMV）DNA病毒，在15分钟内使用未提取的样本检测SARS-CoV-2 RNA病毒，两种情况下的检测限与qPCR相当。sPAMC是一种CRISPR介导的检测方法，具有简单、快速、灵敏、可靠和灵活的优点。它易于使用（one-pot反应无需提取样品）和快速（与等温放大相当的速度）。此外，它与RT-qPCR一样灵敏、可靠和灵活。

图片来源：Nature biomedical engineering

研究团队设计了许多针对SARS CoV-2 Orf1ab和包膜（E）基因的crRNAs。在one-pot反应中，性能更好的crRNA都设计为使用Cas12a的次优PAM（NTTV和TTNT），而不是标准PAM（TTTV）。使用次优PAM的crRNAs产生的侧枝活性比使用规范PAM的crRNAs弱且慢。在one-pot反应中，使用次优PAM的间隔子4和5的动力学速度都比标准PAM快。

为了探索哪种类型的次优PAM在one-pot反应中表现出更快的反应，将Orf1ab基因的间隔子4和5、SARS-CoV-2的Spike（S）基因的间隔子2和人乳头瘤病毒18型（HPV18）L1基因的间隔子1的底物从TTTV点突变为VTTV、TVTV或TTVV。结果表明，在one-pot反应中，80%以上的次优PAM间隔子比标准PAM的反应更快，大多数性能更好的次优PAM为VTTV、TCTV和TTVV。

除此之外，研究团队更进一步设计实验表明使用次优PAM可能是加速基于Cas12a的one-pot试验速度的一般策略。

次优PAM比标准PAM介导更快的one-pot反应。

图片来源：Nature biomedical engineering

以前的研究表明，尽管one-pot CRISPR诊断法操作简单，但其灵敏度低于两步法，即依次进行靶点扩增和CRISPR检测。One-pot反应中，标准PAM对间隔子4的检测限为234fM浓度的双链DNA；相比之下，使用次优PAM的检测限为2.34 fM浓度的双链DNA。

为了比较使用次优和标准PAM测试的可靠性，在底物（2340fM浓度的双链DNA）和培养时间足以满足次优和标准PAM的情况下，次优PAM组的荧光信号在所有重复组中高度一致；相比之下，来自标准PAM组的信号在重复中变化超过10倍。

除此之外，研究团队使用标准或次优PAMs比较了另外2个crRNAs的检测限和可靠性。与标准PAM相比，使用次优PAM的两种crRNAs的灵敏度增加了约10至100倍，信号产生更加一致，表明在one-pot反应中次优PAM的灵敏度和可靠性均得到了提高。

次优PAMs介导one-pot反应的敏感性和可靠性

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研究团队试图了解次优PAM介导的one-pot检测的稳健性能背后的机制。在one-pot反应中，CRISPR检测和等温扩增可能会相互竞争，最终的检测信号可能依赖于目标扩增来生成足够的底物用于CRISPR检测。使用次优PAM的crRNA可能具有较慢的CRISPR检测初始动力学，从而使反应偏向等温扩增。

研究团队用实验证实了这种想法。并且，还为次优PAM如何促进等温扩增提供了一个模型，从而在one-pot反应中实现可靠、灵敏的检测。鉴于CRISPR检测和底物的等温扩增相互竞争，Cas12a对次优PAM底物结合亲和力的降低促进了平衡从裂解向扩增的转移，从而产生足够的检测扩增子；相比之下，标准PAM更强的结合亲和力允许裂解超过扩增，并导至延迟或缺乏扩增子产生，这是观察到的检测延迟和不稳定性的原因，同时降低了灵敏度。

One-pot反应中RPA和crRNA/Cas12a-RNP裂解的竞争

图片来源：Nature biomedical engineering

因此，研究团队开发了具有增强灵活性、速度、灵敏度和再现性的sPAMC。为了确定sPAMC是否能够检测DNA病毒，用双链DNA病毒人类巨细胞病毒（HCMV）测试了该方法。首先比较sPAMC和qPCR的敏感性。两种方法的检测限均为5.953×10−4amol质粒（相当于qPCR中的29.765 aM浓度和sPAMC中的19.843 aM浓度）。sPAMC的荧光信号在大约6-10分钟开始出现，并在大约9-15分钟达到一半最大值。这一速度至少比所有已发表的CRISPR介导的靶向扩增one-pot试验快2到3倍。

用sPAMC检测HCMV病毒样本。结果显示，每个反应的检测限为24拷贝，与qPCR的检测限相当。用简单的紫外光代替荧光光谱来测量信号。在10分钟的时间点，除最低病毒浓度外，所有的紫外检测均显示阳性信号，在15分钟时，病毒拷贝数最低（等于qPCR Ct（循环阈值）值36）的样品明显呈阳性。将sPAMC与侧向流动分析条相结合，这种组合能够检测Ct值为33–34的病毒样本。简单紫外光激发的荧光读数更容易、更快、更灵敏。

应用sPAMC检测SARS-CoV-2。结果显示sPAMC的灵敏度约为STOPCovid的100倍，在检测DNA样本时，sPAMC的速度比STOPCovid快3倍（13分钟对40分钟，荧光达到一半的时间）。研究团队对比了sPAMC和RT-qPCR的检测限（LOD）。实验结果确定sPAMC的LOD为1cpμl−1，与RT–qPCR相似。

最后，研究团队评估了SARS-CoV-2阳性和阴性临床样本中sPAMC的性能，并将其性能与STOPCovid进行了比较。共使用了104份SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样本（48份未提取样本和56份提取样本），Ct值范围广泛（18.1–35.8），以及100份SARS-CoV-2阴性样本。sPAMC的敏感性为94.2%，特异性为100.0%，能够检测Ct值为35.8（1.2 cpμl−1）的样本。阳性信号最早出现在10min，所有阳性样本在15min时均显示信号，可以通过紫外光或简单的蓝光装置检测。

sPAMC的临床应用

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基于CRISPR的核酸检测方法具有高度的特异性，但它们不快速、敏感或易于使用。在这里，研究团队报告了一种一步荧光分析法，用于检测鼻咽样本中的严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA，样本应答时间不到20分钟 与逆转录实时定量PCR（RT–qPCR）相比，灵敏度相当。该分析使用了次优PAM，使CRISPR RNA的设计具有灵活性，并减缓了Cas12a介导的荧光DNA报告子顺式切割的动力学，由于等温重组酶聚合酶扩增产生的扩增子的积累，导至更强的荧光。在一组204个RT-qPCR循环阈值在18.1到35.8之间的鼻咽样本中，该分析检测到SARS-CoV-2，灵敏度为94.2%，特异性为100%，无需提取RNA。One-pot式快速、灵敏的核酸检测方法，允许检测设计的灵活性，可能有助于开发可靠的护理点核酸检测。