技术｜PCR扩增仪，确保PCR性能稳定的关键

当试图从PCR中获得一致的结果时，需要考虑的一个比较明显的问题是反应本身使用的试剂。引物、聚合酶和模板DNA的质量很重要，同时还要避免污染和反应的潜在抑制剂。此外，拥有一个优化良好的PCR方案至关重要的，需要考虑的关键因素之一是用于促进反应的仪器，PCR扩增仪，本文重点介绍优化PCR扩增仪性能的关键考虑因素。

PCR扩增仪有各种形状和大小，有些比其他的更复杂，然而，它们都执行相同的基本功能，温度循环。

PCR每个阶段的温度对反应的成功至关重要，因此，PCR扩增仪的温度在各孔之间和整个组之间准确和一致是至关重要的，这被称为均匀性。

为了确保每次使用PCR扩增仪时都有一致的结果，定期测试和校准温度块很重要。有经验的实验室科学家可以使用温度验证套件进行测试，但是任何重新校准都需要由合格的工程师来进行。

因此，强烈建议由合格的工程师定期对仪器进行维护和保养。这将保证PCR扩增仪保持在最佳状态，并以最佳状态工作。这些定期维护和校准活动的记录也将被要求用于实验室质量认证，如ISO17025。

在PCR循环过程中，控制引物退火步骤的温度是很重要的。如果温度太高，引物退火的效率会降低。太低，它的特异性就会降低，这可能导至非特异性产物的扩增，降低你的PCR的整体效率。

为了确定退火步骤的最佳温度，可以建立重复的PCR反应，每个反应使用不同的退火温度进行测试。

另外，也可以使用带有梯度块的PCR扩增仪。梯度区块允许在整个区块内同时使用一系列的温度，这意味着可以同时评估多个退火温度。一些PCR扩增仪配备了分段式温度块，而不是一体式温度块，这允许同时使用更大范围的温度。

热力块的升降速率也将影响反应的效率。这是PCR循环各阶段之间温度变化的速度。

与老式仪器相比，现代PCR扩增仪的升温速度往往更快。较新的仪器具有更快的整体循环时间和更快的升降速率，这意味着反应混合物在变性、退火和延伸步骤之间的温度时间更短。

一些现代PCR扩增仪可以通过其软件中的特定算法进行编程，以复制旧机器的升降速率。如果一个PCR方案是用旧机器开发和优化的，然后转移到较新的仪器上，这就特别有用。

PCR机器还包括计算反应混合物达到编程温度所需时间的算法，即所需的升降速率。为了使其准确，在PCR扩增仪上进行PCR循环编程时，必须包括反应体积。如果使用的反应体积大于所述，那么机器将错误地认为样品在实际达到所需温度之前就已经达到了。

这对反应的效率有影响，因为样品可能不会在所需的温度下培养那么久。如果样品体积较小，那么就有可能暴露在稍高的温度下。另外，它在该温度下保持的时间也可能超过要求，这两种情况都会影响PCR检测结果的一致性。

除了加热块，PCR扩增仪还有加热盖。这些盖子的温度通常比加热块要求的最高温度高几度，这可以防止样品蒸发到PCR管的顶部，在那里它将不再受到加热块的温度循环的影响。因此，重要的是加热盖被设置为一个适当的温度。

在对仪器进行维护和保养时，应检查加热盖的准确性。

当PCR循环阶段完成后，PCR扩增仪通常被设置为将样品“保持”在4℃，直到用户将其从仪器中取出。

将样品块冷却到这个温度，特别是长时间的冷却，会给样品块带来不必要的压力，并有可能使其寿命缩短10倍之多。为了避免这种情况，可以在程序结束后立即取出样品，或者将仪器设定为在室温下保持样品。

这对PCR产物的影响应该是最小的，因为DNA在室温下是相对稳定的。此外，在低温下保持样品块，可能会导至冷凝水的积累。这不仅可能导至块状物本身的腐蚀，还可能损坏仪器内部的电气元件。

因此，当仪器不使用时，将PCR扩增仪的盖子打开，让任何积聚的冷凝水蒸发，是一个好的做法。

最后，PCR扩增仪内的Peltier块对移动很敏感。为了防止损坏，并确保您的仪器以一致的方式运作，一旦机器安装完毕，最好避免移动它。如果有必要重新安置仪器，那么应注意尽量减少对机器的任何撞击或极端力量。