截止2022年Q1， 在不同测序平台上NMPA获批的肿瘤Panel，如下图，多集中在非小细胞肺癌、靶药的选择，区别除了文库方法、LoD最低检出限等，还在于测序仪不同。
“ 在MRD 微小残留灶应用上，不同检测Panel，不管采用何种路线，最后的呈现主要差异还在最低VAF检测水平，千分位到万分位不断改进。
关于不同测序仪，能否帮助大量的肿瘤Panel，提供差异化性能的话术呢？ 测序聚合反应的差异 目前国内有多款测序仪待NMPA获批上市，如赛纳生物几个月前发布了S100二代测序仪,其特色是所谓 1.荧光发生化学测序和 2.纠错编码测序。第一点体现在荧光基团在磷酸键末端，其随着聚合反应会脱落被检测到，而在测序反应时，合成的碱基类似于天然状态，不会引入”疤痕”, 不会造成空间阻位，所谓Phasing现象。
第二点，是在每个测序循环加入2种dN4P，即2个分子组合，如首先加M组合(包括A和C碱基)，续加K组合(包括G和T)，完成首轮测序，还要进行第二、第三轮的分子组合测序，最终兼并3次测序链的信息得到序列。那么经过多次测序欲提高精准度，但多次测序带来的试剂消耗和TAT时间也是要评估下。初看上去还好，聚合比为：平均每个Cycle可延长约2个碱基，目前公开的评测数据较少。
碱基读取方式的差异 真迈测序仪据悉已获得临床注册受理，先看型号- 单分子测序GenoCare 1600
其碱基读取方式属于两色荧光信号，首先绿色荧光标记C 和T ,红色标记G 和A。第一轮加入2个dNTP，混合荧光先区分碱基，清洗后进入下一个循环，再加入其他2个dNTP, 由激发光区分碱基。有点类似华大CoolMPS，整个循环下来依然要拍 4张images, 速度不够快，但因为其单分子技术不需要扩增，建库简单时间短，所以整体测序时间可接受。 另外硬件方面，采用了叫total-internal reflection-fluorescence (TIRF)的光学器件，可检测单分子下的微弱信号。2台CMOS照相机可最大化单分子的信噪比。为了加速测序速度，整个Flow cell 被虚拟分为两个区块，多条Lanes。不同区块可同时进行流体化学反应，及拍照成像。 在上述体系下，GenoCare 的 mismatch, insertion 和 deletion 的错误比例分别达到 0.61% ，1.45% 和2.76%，依然有提升空间。
而另一型号GenoLab采用较传统SBS聚合, 与某进口平台对转录组等进行平行检测，对于Q20以上的碱基质量分别为94.86%和 97.5%，两者差距不算大。
华大之前发布的 CoolMPS 使用了没有荧光标记的可逆终止子，它采用特定的抗体来检测可逆终止子，如下图。
标记抗体的显著优势是：一个抗体可以标记多个荧光分子。信号更强的好处是测序的数据质量更高，即使DNA纳米球的拷贝数低，也能得到较亮信号。 荧光读取上，华大的两色读取法不同于别家的2-color成像，(别家如下图,无信号下默认为G碱基)。
而华大CoolMPS的两色荧光，使用两轮标记法，分组读取两个碱基，理论上可更好的分离染料色，相机也可以做到轻配置，在文献中有提及降低碱基错误率。但从荧光抗体结合、洗脱检测，到多轮荧光采集，整体的信号读取时间可能偏长，也成为后续升级的方面。 总体来说，肿瘤各类大、小Panel的差异可以体现在性能上，性能也可反应在测序平台，近些年将会有多个国内测序仪获批，不同测序仪采用不同的聚合反应原理、不同的信号读取方式，希望让各个Panel 变得更有特点。 Reference 1.Fang Chen,Two Color Single Molecule Sequencing on GenoCareTM 1600 Platform to Facilitate Clinical Applications，medrxiv,2020 2.Snezana Drmanac, CoolMPS: Advanced massively parallel sequencing using antibodies specific to each natural nucleobase, bioRxiv, 2020 |
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