技术｜免疫诊断试剂开发的九个技巧

免疫诊断试剂是一个应用非常广泛的测试系列，通过使用抗体-抗原结合来检测特定的目标。这可能意味着使用实验性抗体作为工具来检测特定蛋白质的存在，如细胞样品中的核蛋白。相反，它可能涉及使用重组蛋白来检测样品中的天然抗体，例如在人群中寻找对病原体的血清转化。

根据用于识别抗体-抗原结合的检测方法，免疫诊断试剂可分为五组：放射免疫诊断试剂（RIA）、计数免疫诊断试剂（CIA）、酶免疫诊断试剂（EIA）或酶联免疫吸附诊断试剂（ELISA）、氟化物免疫诊断试剂（FIA）和化学发光免疫诊断试剂（CLIA）。

这个技术系列包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）、免疫细胞化学（ICC）和侧向流检测（LFA）等检测方法，其中一些技术，如Western blot，可以采用多种检测方法，因此可以归入多个组别。

无论选择哪种具体技术，在开发、使用免疫诊断试剂或排除故障时，都有一些共同的因素可以而且应该考虑。在本文中，我们将考虑其中的一些技巧和窍门，以帮助你完善免疫诊断试剂并取得最佳结果。

在选择了你的检测目标后，或者在寻求改善现有检测的性能时，非常值得花时间和精力为每个目标尝试多种抗体。这可能包括同一目标的不同表位的抗体，多克隆与单克隆，不同的宿主物种，或者甚至只是来自不同供应商的抗体。

抗体是生物试剂，因此，即使是来自不同批次或供应商的“相同”抗体，在其检测效果上也会表现出固有的自然差异。

样品中不同的表位结合的可用性在不同的样品类型或条件下可能有所不同，所以要确保你的检测方法与实际使用的样品类型相同。其他研发工程师分享的关于抗体性能的数据对于选择一个合适的抗体也是有指导意义的。

对通过免疫诊断试剂获得的结果进行独立验证，如通过非抗体依赖性成像或蛋白质组学分析，对确定观察结果的有效性很有帮助。尝试和验证不同的抗体，虽然很费力，但从长远来看，在努力提高结果的过程中，是值得花时间的。

虽然抗体是免疫检测的核心，但在实验过程中通常还有一系列其他的试剂和材料，它们都会对一个人的检测获得巨大的成功或彻底的失败起到一定的作用。以Western blot为例，有多种具有不同特性的膜类型可用于印迹过程。

即使选择了一种膜类型，在不同制造商生产的同等膜之间也可以看到性能上的显著差异，横向流动膜也是如此。

在利用塑料器皿固定的免疫诊断试剂中，如ELISA，有一系列不同的材料可供选择，有一系列不同的表面处理和结合特性，所有这些都会影响到测定的有效性。从本质上讲，不要满足于你手头刚好有的材料，如果可能的话，要尝试不同的选择和不同的品牌，并对它们进行平行试验，以找到能提供最佳结果的产品。

缓冲液“设置了环境”，在免疫诊断试剂中会发生或不发生结合反应，所以它们提供合适的条件很重要。不仅要尝试不同的缓冲溶液，还要尝试这些溶液的不同浓度。

即使是一个很小的浓度差异也能使检测成功或失败。这不仅适用于检测本身的缓冲液，也适用于上游过程中使用的缓冲液，如重组蛋白的制备或样品的储存，因为这些缓冲液可能会被带到免疫检测中并造成干扰。

你的手中可能有世界上最好的检测方法，经过优化和改进，已经到了炉火纯青的地步，但如果一个人的样品质量很差或没有得到适当的保管，其结果很可能会令人失望。

从采集样品开始，无论是血液、组织、细胞、微生物还是其他什么，对其保管得越好，从中获得的结果就越相关和有意义。

当考虑到实际的诊断样品时，这一点尤其重要，因为样品的保存时间会影响到阳性与阴性的结果，没有人喜欢假阴性或假阳性，两者在不同方面都会有同样的问题！

随着时间的推移，蛋白质（包括抗体）会降解，在温度升高、pH值变化、渗透压变化和破坏性化学物质等因素的作用下会加速降解。

理想的条件在很大程度上取决于一个人的样品类型，所以做足功课是很重要的。一般来说，低温和生物相关的缓冲条件可能是最好的。冷冻样品可能是可以接受的，但在一些样品类型中可能会导至目标损伤和降解，反复的冻融循环对大多数样品肯定是有害的。

许多（但不是全部）免疫诊断试剂包括多个阻断和结合步骤，在最终的可视化之前，要进行清洗。虽然它们可能看起来是检测中最不重要的部分，但清洗步骤是至关重要的。洗涤太少会导至检测时出现高背景信号，产生“噪音”结果。洗涤太多，信号可能会减弱，有时甚至没有。

不一致的洗涤也会带来自己的问题，导至实验内和实验间的差异以及结果解释上的困难。当整个板块或样品出现无法解释的变化时，可以看到单个实验中的洗涤不一致。

以96孔板式检测为例，如ELISA，如果使用自动洗板机，最好检查所有孔是否被均匀清洗。这种仪器所需的细管很容易堵塞，因此在将实验板委托给设备之前，用一个空板来检查所有的孔是否均匀地分配和排空。

如果用多通道移液器手动执行这项任务，请确保所有的吸头都牢固地、平等地固定，以防止分配和排空不均。

例如，如果是清洗膜，确保膜被完全浸没，因为暴露的部分将保持不被清洗。使用磁力搅拌器轻轻搅拌洗涤液也是一个好主意（不要太用力，否则有损坏膜的风险），使洗涤液在整个膜上均匀地循环。

上面提到了洗涤的一致性，但是一般来说，由于同样的原因，一致性也很重要。这也包括诸如孵化时间和温度等因素。理想情况下，人们希望在不同的实验、或实验中的通道或孔之间变化的唯一因素是样品。

在可能的情况下，包括技术重复和生物重复，对挑出异常结果最有帮助。然而，最理想的是采取一切措施，首先防止异常现象的发生。这包括诸如移液精度、试剂制备、设备护理、服务和校准等因素。

例如，当转换到一个新批次的抗体或平板时，如果可能的话，用新旧两个批次的样品都运行一下，以考虑到可能出现的任何不一致的情况。

与大多数检测一样，包括适当的质控是确定实验过程中获得的结果有效性的最重要因素。不包括质控意味着，无论结果看起来多么“好”，它们都变得毫无意义。

阴性质控可以将没有信号解释为没有目标，而不仅仅是测定的失败。例如，在许多LFA中，即使测试带是阴性的，也包括一个控制带以确认检测成功。同样，阳性质控使信号的存在，或在特定位置的信号，或特定大小的信号被解释为目标在一个人的样品中的存在。

例如，当进行Western Blot检测细胞裂解液样品中的特定蛋白时，同时进行纯化的目标蛋白样品可以帮助从背景信号中识别目标带。跨越目标浓度或表达水平范围的质控物也有助于解释未知样品中的水平，这对定量或半定量测定特别重要。

以ELISAs为例，确定病人样品中某种抗体的水平是低、是中、是高，有助于临床解释，也有助于确保结果保持在检测的动态范围内。

在一次检测中检测多个目标可能是可取的。在诊断测试中加入一个以上的靶点可以提高测定的可靠性、敏感性和特异性，特别是当靶点有可能丢失或变异到测定不再有效时。同样重要的是要考虑到宿主对抗原的反应方式存在自然差异。

不同的靶点可以组合在一起，以便从一个样品中检测多种病原体或相应的免疫反应。在处理自然或实验衍生的基因敲除菌株或细胞系时，检测多个靶点也特别有助于定位不同的细胞群。

例如，检测一个应该存在于所有细胞中的目标，如一个核蛋白，与你旨在检测差异表达的目标同时进行。

对于一些检测方法，如ELISA，这可能意味着运行额外的反应，而其他免疫检测方法可能是复用的，因此在同一个样品中可以同时检测多个目标。虽然有可能非常有用，但多重检测可能非常具有挑战性。

检测一个目标的理想条件可能与你希望与之结合的另一个或多个目标不一样。这可能意味着要回到基础设计上进行更多的优化，或者如果每个目标发挥作用的条件过于悬殊，就要选择不同的目标组合。

当使用依赖于荧光观察的检测时，确保为每个目标选择的荧光团有足够的不同，以提供简单的区分。在某些情况下，为了检测一种成分，你可能不得不在检测的一个方面做出妥协，以提高组合检测的整体性能。

在创造了或得到了一个成功的免疫诊断试剂方法后，不幸的是工作还没有结束。建议随着时间的推移监测结果，以确保检测性能没有恶化。如果检测方法包括标准品，可以使用这些标准品进行比较。

虽然由于用户间的差异、环境温度的波动等原因，可能会出现一些自然变化，但在较长的时间内进行比较可以发现任何系统性的性能下降。这可以提醒用户注意一个问题，使调查和纠正措施得以采取。

性能下降可能有很多原因，但要记住的常见原因是试剂随时间的推移而变质，不适当的样品处理或储存，材料或试剂供应商或批次的变化以及员工培训。

还值得注意的是，现实世界的情况可能会改变。例如，病原体不断演变，15年前你选择的抗原目标，现在可能已经不合适使用了。