【冯仁丰】系列讲座 7 回收实验

回 收 实 验

冯仁丰

一、手工操作与自动化操作的差异

临床检验的技术和概念，应该分为原先的手工操作和自动化操作。临床检验是从手工操作走向自动化操作的。至今也许还有许多人，以为自动化只是以机械动作替代了原先手工操作的做法而已。这是非常错误的！因此必须深入了解原先的手工操作，与现在的自动化操作之间的巨大差异！

临床检验的历史不长。顶多上百年。而使用化学试剂进行化学反应对分析物检测的历史，则更短。进行免疫方法检测的历史，还要短！只是70年左右的时间。至今，那些稍稍老一些的检验人员，如我经历过手工操作和自动化操作变更的人员，也许体会更多一些。但是，每个人有不同的认识和体会。在自动化仪器进入中国前，已经有不少检测方法为了适应自动化，有了很大的改变。可是，国外、尤其是国内，还体会不出，那些在操作上的变化，不仅仅是操作简单快速，而是许多做法和概念上的更新！我们当时，也包括我在内，只是看了报告的文章，发现检测方法有了很大改进，简化了操作。国内一些老前辈也纷纷在实验室模仿使用。但是，引入的后果浑然不知！严重影响了检测结果的准确度！还作为首先使用的人，在国内进行推广应用！

举例来说：肌酐、尿素、葡萄糖。这三项从引入国内作为经典的临床化学的主要项目，无一不是要进行无蛋白处理！对病人全血加入钨酸试剂后，过滤得到无蛋白血滤液。然后分别使用不同试剂进行检测，得到各个结果。有名的Folin-Wu名字，也许大家会知道。就是这位吴宪前辈，在拜Folin为师读博士学位时，实验解决了Folin无法使用碱性苦味酸去检测血液内肌酐的难题！吴宪发明了首先用钨酸沉淀血液蛋白和所有有形物后，对滤液进行检测。这个方法被推广到全世界！这样，使得很多原先无法检测血液内的分析物，现在都可以进行了！我1965年进入上海市医学化验所。在临床化学室，检验老师告诉我：临床化学最要紧的是两件事:做好无蛋白血滤液；第二标准要准。你的检测结果肯定没问题。但是，每天对所有标本必须进行钨酸试剂处理，要得到这些滤液很艰难！冬天沉淀很慢，费时费力！

国外报告了肌酐检测，可以不要进行钨酸前处理。直接使用血清加碱性苦味酸试剂，就可以比色检测了！这个方法很快在国内推广，而且即刻被写进检验书内！大家感到这样的方法多好！解放了劳动力！简化了操作！可是几乎没有人深入去思考：为什么原先做无蛋白血滤液，只是为了用全血做标本！现在用血清了，所以不必再做无蛋白血滤液了。

当时，临床实验室要了解检测结果的可靠性时，大多会做回收实验。但是怎样做回收实验？怎样的计算值可靠的？很少深入了解。我是在上世纪70年代，学到了Westgard的方法学评价系列文章。非常高兴。其中就有如何进行回收实验。当时我们已经自己制备控制品。为了了解，对处理过血清内外加肌酐后，血清内的肌酐浓度是否达到我们预期的要求。因此，开始进行回收实验。

二、回收实验实例

回收 (recovery)，分析方法对于样品中分析物的适当增量能实际检出的能力。用于该目的的实验为“回收实验”。

回收实验 — 用以估计比例分析误差。这个类型的误差随分析物浓度增加而增加。经常因化学反应引起，在样品基质中一些其他物质与分析物竞争分析试剂所致。在回收实验中，回收检测样品内对样品加入一个标准溶液。基础样品为在第二个原样品内加入与检测样品被添加标准液体积相同的水。然后检测这两个样品。两个样品检测值的差异，即为被回收的量。1、标准添加体积要小。不要过于影响样品样品的原始基质。因此加入标准液的体积保持在样品体积的1/10之内。2、加样器或吸管要准！是你决定实验可靠的关键之一。为了使加入分析物浓度要适当，但体积又小；所以，需要提高加入分析物标准液的浓度。进行重复检测，去均值。减少不精密度影响。

手工碱性苦味酸法测定肌酐是常用的方法，多以肌酐标准水溶液为标准。这样的做法对病人样品的检验结果有多大的影响？为此，设计回收实验以了解标准与病人血清间明显基体差异产生的基体效应。请注意：这个肌酐检测使用了直接方法，即不对血清进行无蛋白处理的方法。因此检测的是血清；但使用了肌酐水标准液。有问题吗？

（1）在进行回收实验前，应该先用浓的肌酐标准液绘制标准曲线，了解苦味酸方法对纯肌酐显色反应的线性范围。所有回收实验的肌酐浓度不能超出该范围，否则回收结果本身不可靠。其他有关的注意事项参见前述的内容。

（2）收集混合血清，经过离心、过滤后备用。另外，将肌酐储存标准液用0.1mol/L硫酸稀释成：10 000、6 000、4 000、2 000、1 000 μmol/L肌酐标准液。按表2配制系列回收样品：

三、回收结果的表达

共有5例回收率结果，取平均回收率表示方法的回收水平。平均回收率为87.74%。理想状态的回收率为100%，它与   的差表示由回收实验估计的比例误差（proportional error , PE ）的大小。比例误差表达的方式有两种，一种直接用相对于100%回收率的差表示，写成PE( % )；一种是在医学决定水平分析物浓度下具有的比例误差量，直接以分析物浓度表示，写成PE。

进行回收实验计算上，还有人错误地将原样品中具有的分析物浓度也一并计入。这是错误的。回收指的是，实验加入分析物增量，实验是否可正确检测。与原样品中有多少分析物无关。如果要计入原样品中分析物浓度，将会有很大的误解。如样品中原分析物浓度为100，现加入的分析物为1。若该样品现在检测的浓度为100，按照错误理解，回收率为:100/101!几乎为100%！实际回收率为0！

四、总结

实验究竟错在哪里？重新阅读我2007年写的“临床检验质量管理技术基础-第二版”书后，我顿时羞愧难言！因为，我在书中讲的以回收实验去估计基质效应，是非常错误的！我要向所有读者抱歉！认错！还是这次有同道要我对回收实验做介绍，翻阅这本书这个内容，才发现有严重问题！

如果，我们依然如多年前手工操作那样，在使用碱性苦味酸检测前，首先对血清以钨酸处理；得到上清滤液后，再用碱性苦味酸检测内含的肌酐，这是可行的。因为，此时使用水配制的肌酐标准液与检测样品具有非常相似的基质状态。对滤液内加入肌酐标准液，这个回收样品与未加过标准的回收对照样品，也具有几乎相似的基质状态。这样一组回收样品与苦味酸反应，与标准肌酐的苦味酸反应几乎一致。由此，可以从反应的回收率，了解检测结果的正确度！但是，在上世纪70年代起推出的肌酐直接方法，没有考虑基质效应的影响。

标准液参与苦味酸显色反应时，与标本参与苦味酸反应具有的基质状态完全不同！因此，一定会严重影响检测结果的可靠性！在这个情况下，还用标准液进行回收实验，无法说明这个实验究竟揭示了什么问题。因此，回收实验只能诸如以往的经典钨酸前处理后，再用碱性苦味酸显色的肌酐方法！

今天，在临床实验室使用的检测方法，几乎全部是为自动化考虑的。也即，对人来源的血清、血浆直接在反应杯中，加入试剂反应。在这样的情况下，必须使用具有相似基质的标准作为参考。这个要求，促使推出了校准品。但是，校准品的定值又成了非常关键的内容。推动了互换性、溯源性、一致性的观点！无论什么实验，这些观点和做法，都离不开最最基本的方法学比较！以方法学比较说明情况，比什么都强！

临床实验室使用的检测方法，一直随着时代在进步和发展。为了得到准确可靠的结果，一代人推着一代人向前去努力。今天的临床实验室离不开体外诊断产业的发展和贡献！临床实验室必须牢记:为了中国老百姓，一定要做一个有良心的人！做出对得起老百姓的可靠结果！一起为中国的发展做贡献！再次向国内所有临床检验界同道，表示深深的认错！我一定继续努力学习！跟上大家一起为中国的临床实验室献上一份力量！