技术｜一篇文章让你了解什么是ELISA方法学

酶联免疫吸附试验通常在96孔微孔板中进行，微孔板上涂有对相关分析物的特异性捕获抗体。在与实验样品、标准品或对照品孵化时，目标分析物被该抗体捕获，一个共轭的检测抗体与目标分析物上的不同表位结合。随后加入底物溶液，产生一个与分析物结合量成比例的信号。

ELISA的四个主要方法学是间接法、直接法、夹心法和竞争法，每种类型的ELISA都有自己的优势和劣势。

2.1、直接法

在直接法中，抗原或样品被直接固定在平板上，一个共轭的检测抗体与目标蛋白结合。然后加入底物，产生一个与样品中分析物数量成比例的信号。由于在直接法中只使用一个抗体，它们的特异性比夹心法低。

在评估抗体亲和力和特异性，或者调查阻断/抑制性相互作用时，我们会选择直接法进行检测，直接法是一种快速和简单的方法，但是它的特异性较差，因为只使用一个抗体，同时如果一个样品中的所有蛋白质都被固定在孔中，可能会出现高的背景杂音。

2.2、间接法

间接法与直接法相似，抗原被固定在一个板上，但它包括一个额外的扩增检测步骤。

首先，加入一个未结合的初级检测抗体并与特定的抗原结合。

然后加入针对初级抗体的宿主物种的结合的二级抗体。然后底物产生一个与孔中结合的抗原量成比例的信号。

在测量内源性抗体时，我们会选择使用间接法，因为它使用使用第二抗体进行扩增，特异性更好，但这也带来了一个问题，二次抗体有可能引起交叉反应。

2.3、夹心法

夹心法是最常见的ELISA类型，它用两个特定的抗体被来夹住抗原，这通常被称为匹配抗体对。

捕获抗体被涂在微孔板上，加入样品，感兴趣的蛋白质结合并固定在板上。然后加入共轭检测抗体，与目标蛋白上的另一个表位结合。加入底物并产生一个与样品中存在的分析物数量成比例的信号。夹心法具有高度的特异性，因为需要两个抗体与感兴趣的蛋白质结合。

我们在确定生物样品中的分析物浓度时，往往会使用夹心法，这就是因为它具有最高的特异性和灵敏度，并且适用于复杂的样品基质，但需要注意的是，夹心法往往检测时间较长，而且开发难度要大于其他方法学。

2.4、竞争法

竞争法通常用于检测小分子，例如当感兴趣的蛋白质太小而不能有效地与两个抗体夹层时。

与夹心法相似，捕获抗体被涂在微孔板上。不使用共轭的检测抗体，而是使用共轭的抗原来完成与样品中的抗原的结合。样品中存在的抗原越多，共轭抗原与捕获抗体的结合就越少。加入底物，产生的信号与样品中存在的蛋白质数量成反比。

我们在测定小分子和荷尔蒙的浓度，会使用竞争法，这也是由于它具有对小分子进行定量的能力，但是，竞争法的特异性较差，因为只使用了一种抗体，而且需要有能够结合的抗原。

有许多不同的免疫测定平台可用于测量生物体液中的蛋白质水平。在许多情况下，由于ELISA的灵敏度、特异性、准确性以及对苛刻的缓冲液或预处理的耐受能力，ELISA是首选。

比较ELISA和Western blot，夹心法使用2个特异性抗体而不是一个，可以得到完全定量的结果，而Western blot可以看到非特异性条带，最多只能是半定量的。

而与不同的复用平台相比，ELISAs的一个优势是能够为目标分析物定制检测方法，而且不必担心许多其他抗体和蛋白质一起工作造成的干扰。

而且，通过对使用的抗体、稀释剂等进行优化，可以极大地降低交叉反应或干扰的可能性，从而实现在复杂的样品基质中对分析物有出色的灵敏度和特异性。