微滴式数字 PCR 联合叠氮溴化丙锭技术计数不可培养的霍乱弧菌活菌

许多种类的细菌包括霍乱弧菌（引起霍乱的病原体），当暴露于不利环境（如饥饿、低温、次优氧化还原条件、辐照和抗生素压力）时会进入存活但不可培养（VBNC）状态。VBNC 细胞的鉴定、检测和分化对于微生物学研究和疾病监测/控制都是非常重要的。

VBNC 状态下的霍乱弧菌与死细胞之间的区分很有挑战性，尤其在低细胞浓度的水生生态系统样本中。传统的计数方法难以对 VBNC 细胞进行定量，因为它们不可培养。而基于形态学的计数也无法区分活细胞和死细胞。PMA-qPCR是检测 VBNC 细胞的方法，它利用PMA（叠氮溴化丙锭）可以穿透受损的细胞膜并且插入 DNA 中从而抑制 PCR 扩增的原理，并已成为区分活细菌和死细菌的常用方法。

ddPCR 是一种无需外部标准即可量化目标基因拷贝数的独特方法。在 ddPCR 实验中，DNA 样品及反应体系被随机分散到油包水液滴中进行 PCR 扩增，然后通过荧光检测器对液滴进行逐个分析，从而对目标 DNA 进行量化。ddPCR相对于qPCR具有更高的灵敏度，且数据准确性和精确性都有提升。已有报道PMA 处理结合 ddPCR 分析 (PMA-ddPCR) 已被用于定量检测粪便样本中的细菌存活率。

最近，来自中国疾病预防控制中心的研究人员开发了基于qPCR和ddPCR的方法，通过计数样本中单拷贝基因的数量，进而得到 VBNC 状态下霍乱弧菌细胞的数量，并利用PMA区分死细胞和活细胞。

研究人员对比使用 qPCR 和 ddPCR 两种方法定量分析 VBNC 状态细胞的 DNA 拷贝数，在霍乱弧菌 c6706 株 VBNC 状态发育的第 70 天取样；三个基因(VC1376，thyA 和 recA)被用作计数的靶标基因；通过ddPCR和qPCR 计数不用或用 PMA 处理的总 VBNC 细胞和活细胞(图 1)；根据每毫升三个基因的DNA 拷贝数来报告每毫升细胞的计数(注意每个细胞有一个基因拷贝)。

研究人员收集了在第 0，10，20，30 和 70 天有和没有PMA 处理的培养样品，提取细胞 DNA 并通过 qPCR 和 ddPCR 测定。可培养的细胞计数(在LB-琼脂平板上测定)逐渐下降，30 天后降至0(图 2a)。通过 Live/Dead 染色，PMA-qPCR 和 PMA-ddPCR 证实活细胞计数(图 2)。用 VC1376、 thyA 和recA 分别用 PMA-qPCR 和 PMA-ddPCR 检测活细胞计数，从第 0 天到第 70 天呈缓慢下降趋势，从 6.09-7.01 log10 DNA 拷贝/mL 下降到 5.21-6.23 log10 DNA拷贝/mL (图 2e，f)。根据图 2b-f 提供的数据，PMA-ddPCR 在每个时间点和每个基因的 DNA 拷贝数/mL 略低于PMA-qPCR；ddPCR 得到的数据比 qPCR的数据有更高的精密度。因此，ddPCR在基因拷贝计数方面具有比qPCR更高的重复性。

研究表明，ddPCR 显示出比 qPCR 更高的准确性和灵敏度。可直接计数，无需建立标准曲线的PMA-ddPCR 方法作为定量检测霍乱弧菌 VBNC 细胞的新工具，还可以扩展检测其他种类的无法培养且处于VBNC状态的细菌。