【冯仁丰】系列讲座 5 基质和基质效应临床实验室认识和实践 3

基质和基质效应临床实验室认识和实践

冯仁丰

干扰与“基质效应”间的区分从来不是明确的；所以不应鼓励使用“基质效应”。而且，基质的所有定义无法确定与分析物本身的差异。例如，因存在动物来源的酶在性质上出现的误差，不可被称为基质效应，由于分析物本身存在于一个被改变的或异常的形式。此点非常重要！切不可将外加的动物来源的酶，以提高酶活力的行为，视为基质效应！这是分析特异性的问题。

这次深入学习，是对我以往基质效应错误理解的清算！注意：基质的定义是除了分析物之外的、在样品中的所有组成。为了使处理过样品的稳定，添加了防腐剂和/或抗生素、稳定剂；也进行冷冻干燥处理；导至血清标本物理的变化、又进一步改变了标本的性质。这些对样品内基质的改变，使检测结果变化的，可认为是基质效应所致。为了增加处理过内含的某些分析物浓度，添加了各种类型的“分析物”。有人来源的分析物，但更多的是动物来源的分析物；也有是基因重组的分析物等。如添加猪来源的多肽激素、或补充来自细菌获取的酶等，物种特异性的差异（非人来源的校准品，如：猪的胰岛素）；分子种类的整合（完整绒毛膜促性腺激素，hCG）、hCG的β亚基、或β亚基的碎片；它们没有改变样品的基质状态，因为它们不是样品的基质，它们是重新组成的“分析物”。因此，这些对检测结果的影响，不应列入“基质效应”。

在很长的时间里，临床实验室错误地将处理过样品与天然样品间检测结果的差异，均被认为是基质效应所致。就像我的错误认识。其实，在40多年前，Dr.Rej指出，这应该认识为没有互换性。可惜我们对互换性的认识还只是开始。其实，当时Rej认识的互换性，与今天严格限制互换性只用于参考物质是不同的。

控制品必须内含分析物稳定、冷冻干燥后的冻干血清复溶后血清必须洁净。因此，原始的血清材料必须先行处理内含的α脂蛋白。但是沉淀α脂蛋白后，又必须透析去除所有沉淀剂。使得原先血清材料内的所有小分子物质全部损失。为了符合临床实验室的需要，必须加入各种“分析物”。

市售血清制品是实施酶活力检测质量控制计划的完整组成。但是，这些物质的性质和临床标本会有显著差异。它们与临床标本的差异有：酶的物种起源；同工酶形式；分子种类的完整性；溶液的基质；诸如冷冻干燥的处理；和添加的防腐剂等。在检测某个样品单个酶活力间有显著差异。在检测技术这些变异每一个对检测响应，会在这些标本类型间会有差异。为了是可接受，质量控制物质必须具有的性质与临床标本应很相似。所以，我们（Rej）发明了互换性（commutability）概念，首次应用到酶活力检测依然有用，它进一步应用到“基质效应”的问题在这里被反思。注：请注意，提出互换性的也是Rej！

用于质量控制和能力验证试验的标本，会与临床标本有显著差异。这些物质性质的差异包括酶的种类和同工酶特异性；分子种类的完整性；主体基质的起源；和添加的防腐剂和/或抗生素。在替代物和真正的血清标本的性质差异，会影响实际的酶活力检测。

美国CLIA’88法律和法规，强调对被认可的实验室质量，进行能力验证重要性。但是，有许多问题，如果质量控制物质必须的功能没有展现出如人血清样品的功能，那么怎么实施能力验证？我们的互换性概念，20年前首先被应用到酶活力检测。应给予充分重视。

使用病人标本修正去设定校准品值实现常规临床化学方法的准确度

Fred D. Lasky，PhD

在数天内对包含在可报告范围的病人样品，以参考方法或方法学原理的方法进行重复检测。然后这些病人样品结果均值被用来建立校准曲线，依据浓度与常规方法的初始相应的关系，在同一天对相同病人样品也在干片仪上进行重复检测。每天，多个稳定的校准品、连同控制品包括在这些检测中。每个校准品以等同浓度设定值，通过预测该浓度会存在于被检测的病人样品在干片分析仪上的响应中。即仪器检测响应（supplementary assigned values，SAV）。临床化学定量检测的干片技术有多个优点，包括使用少量样品量和对内源性（和外源性）干扰最小的敏感性。但是，该技术，使用了反射分光光度法，要求在改变我们在溶液化学中考虑的做法。不可使用一般常规中使用一级标准的水溶液去校准干片。干片要素的独特性质和分析样品的复杂性，即，有时候是蛋白、底物、电解质、和激素等的非均相的一个混合物，它们间的相互反应，依然还未完全理解。

在信赖的检测系统（为稳定的试剂和特定方法）上，对没有出现正常干扰的病人标本，检测得到该检测系统的准确结果。该检测系统的病人标本检测结果，应有校准计划使得结果可溯源到确定方法或参考方法、或方法学原理。

约上百例病人标本分布在被检测的可报告范围，在4到6天内以参考方法（或需要比对的检测系统）对分析物进行双份检测取均值，得到检测值为X。相同人血清标本在Ektachem分析仪上进行双份检测得到检测信号为Y。以X和Y建立校准曲线。参见下图。

图中X为参考方法或指定检测系统对病人标本的检测值。Y为强生仪器对标本检测得到的反射比色吸光度。

经许多次上述的检测，可以较正确地绘制出，以强生反射比色读数，样品内分析物浓度与强生干片检测得到的反射吸光度关系。此时，将校准品插入参与相同反应，在相同批号的干片下，经反复实验，从得到的反射比色读数，推算出在该批干片下，该批号校准品的值。见下图。

图示为强生干片对无机磷检测校准品定值示意图。图底部为干片经血清检测得到的反射吸光度。图左侧为新鲜血清在干片上反应时，有参考方法或认可检测系统确定的分析物浓度。

在Fred Lasky报告上，30年前就已经确定了，必须使用真实病人标本，作为正确度的传递手，为一个检测系统的校准品定值。这样的做法，也已经成为今天所有自动分析仪为校准品定值的经典做法！

理想的校准品基质应具有两个重要的性质。首先，基质应含有所有的组分，在浓度上与病人标本中相应。这样，校准品液体和标本在检测中的化学反应性具有是等同的合理可能性。化学反应性是在基质中所有成分的活性的函数，正如被基础的物理化学原理预示的。所以，基质效应不是简单地与化学干扰有关，经常未被证实的，但发现在标本中。

第二，理想的基质应是物质，容易制备、稳定、和恒定。批间变异应保持在最低，仅在不显著影响校准稳定性的特性下，批间变异应保持在最低的限值之内。这样，可以实现整个时间病人诊疗的恒定和可靠的结果。

不幸的是，这两个目标经常是不一致的，只能折中。允许适当的稳定性和基质类似于病人标本，经常形成的校准品产品，很接近，但从来没有完美实现这两个重要的目的。以蛋白为基础的校准品要求冷冻干燥、或深低温、或添加非生理性的稳定剂 -- 所有这些引起来自病人血清标本的性质的改变。简单的缓冲液体，仅添加需要的物质或化合物，很容易制备，但它们没有类似到天然的生理状态。

厂商现在可提供稳定、可靠的系统，使各个实验室实现一致、准确的结果。常规临床方法的准确度可以溯源到参考方法，或方法学原理，通过使用病人标本的相关，去建立相应的校准参数。厂商可有效地和经济地提供这个溯源性，因为规模效益--一个厂商支持了成百上千的临床实验室。需要使用病人标本作为准确度的转换依赖，避免了基质效应的的复杂性。在“病人标本等同”下对校准品设定值，因为仪器上具有的检测信号（在反射分光光度法的Dr）与病人标本中浓度准确检测相当，这是系统设计的目的。我们已经展现了这个系统在实现我们的目的是有效的。