酶、抗原/抗体及DNA/RNA等生物分子在电极表面的有效固定对于电化学生物传感器的检测性能至关重要，对灵敏度、特异性、稳定性及重复性等指标都有重要影响。
下面介绍几种常见生物分子电极表面的固定方法，分享给各位小伙伴们！ 
酶（enzyme）是一种具有生物催化功能的大分子物质。酶的固定方法有三种：载体法、包埋法及交联法。
1、载体法 载体法是指利用酶和支撑载体之间的相互作用力，例如：范德华力、疏水力、离子或共价结合力等，将酶固定于载体材料上的方法。
比较而言，离子或者共价结合力较强。常见载体有有机高分子材料、生物聚合物、水凝胶、无机材料及智能聚合物等，详见下表。 
2、包埋法 包埋法一般是指物理包埋，是利用物理作用将酶包埋并固定在高分子聚合网状基质中。
包埋法的优点是一般没有化学修饰，对酶活性影响较小，同时包埋膜材料的几何形状和孔径可控，被包埋物不易渗漏，底物分子可以在膜中任意扩散。包埋法的缺点是过大的底物分子在包埋网状基质内扩散较困难，因此不适于大分子底物的测定。
常用于包埋酶的物质有有机大分子、溶胶-凝胶、有机硅弹性体、聚二甲基硅氧烷膜、中空纤维膜及微胶囊等。研究表明，在溶胶-凝胶体中适当添加聚乙二醇、聚乙烯醇和白蛋白等，能有效提高酶在基质中的稳定性。
3、交联法
交联法是利用酶与具有双官能团的交联剂之间的共价结合，将酶分子直接固定的方法。双官能团的化学交联剂是指具有两个功能基团的试剂，其能与酶表面的氨基发生共价交联。最常用的交联试剂为戊二醛。此方法的缺点是酶活性较低、重现性差、机械稳定性差，以及凝胶处理困难等。
抗体是免疫系统的一种具有高特异性的大型Y形蛋白质，是免疫生物传感器的主要生物敏感分子。通常，抗体结合特异性抗原的部位为Fab部分，如下图所示。 随机固定抗体的方法可能导至Fab部分在电极表面不能充分暴露，从而影响抗体结合抗原的效率和活性，如下图所示。因此，最佳的固定方法是尽量使Fc段与电极表面结合，完全暴露Fab段。
常见的抗体固定方法有：物理吸附法、化学交联法、蛋白A共价连接、层层自组装单层膜等。物理吸附法即直接利用抗体与材料表面的物理相互作用力将抗体固定的方法。例如，利用硝酸纤维素膜、聚苯乙烯、水凝胶等三维多孔材料表面和聚赖氨酸表面直接吸附抗体分子。虽然该方法简便易操作，得到很多研究者的青睐，但是该方法固定的抗体取向随机，结合强度较弱。化学交联法同酶固定中的交联法，最常用试剂有戊二醛、碳二亚胺及琥珀酰亚胺酯等。该方法的主要缺点是反应控制较难、抗体需用量大、蛋白分布随机、生物活性差。
蛋白A是金黄色葡萄球菌的一种胞壁成分，分子中有四个与免疫球蛋白G的Fc片段高亲和力结合的位点，同时其可与金电极表面的金原子之间依靠分子间的作用力而紧密地结合，因此常用于金电极上抗体的定向固定。固定时，首先将结合蛋白A固定到固相表面，然后再利用它们与免疫球蛋白G的Fc段的特异性结合来固定抗体分子。这种固定方法能使抗原结合抗体的位点Fab片段裸露在修饰膜的外层，易于抗原的结合，从而实现对抗原的检测。同时通过调节pH和离子强度可以改变蛋白A与抗体的亲和能力，便于实现免疫传感器的再生。层层自组装单层膜固定方法属于一种间接固定的方法，主要是采用中间连接层（如硫醇、亲和素等）将抗体固定于传感器表面。固定中，自组装膜中的活泼性尾基（如—COOH、—NH2、—OH等）在EDC/NHS、N/N'—羰基二咪唑（CDI）、戊二醛及三氯—S—三嗪（TST）等的作用下被活化形成活泼酯或酰氯等活泼化合物，进而与抗体中的氨基反应生成酰胺共价键，从而实现抗体分子的固定。这种自组装技术固定抗体有很多优势，例如：特异性高、结合力强、稳定性高等特点；缺点是过程相对复杂、成本较高。实践证明，通过化学反应共价结合是载体表面固定抗体的最佳方法。常见的自组装单层膜有生物素-亲和素、聚乙二醇、生物分子（多肽链、ssDNA）等。
DNA/RNA是由脱氧核糖核苷酸/核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状生物分子。常用于固定DNA/RNA分子的方法有：吸附法、自组装法、生物素-亲和素固定法及共价结合法等。首先，可以采用酶、抗体固定方法中的直接物理吸附法固定DNA/RNA，如硝酸纤维素膜法。其次，因为DNA/RNA片段中磷酸骨架带负电荷，所以通过静电作用，DNA/RNA可以直接固定在带正电荷的电极表面，还可以利用电化学富集吸附法，在恒电位下将DNA/RNA吸附到电极表面。该方法固定的DNA/RNA在高盐浓度的环境中容易从基质表面脱落，所以不适合在高盐浓度条件下使用。通过吸附法固定的DNA/RNA是随机分布在电极表面的，因此固定化密度较小，检测效率较低。除此之外，利用不同的聚合物材料也可对DNA/RNA进行固定，如功能化的嵌段共聚物、琼脂糖等。一种是在合成DNA/RNA链时，一端直接修饰巯基基团（—SH），利用巯基基团和金（Au）表面的共价结合作用形成的Au—S键直接将DNA/RNA固定在电极表面。因此对于不同材料的传感器表面，DNA/RNA链的修饰可以先通过自组装修饰纳米金后再固定。另一种方法是在合成DNA/RNA链时，一端修饰—COOH、—NH2等官能团，利用其他自组装高分子材料与之发生脱水缩合反应，可以将DNA/RNA链固定于传感器的电极表面。自组装方法固定的DNA/RNA结合牢固、高度有序、稳定性好。但该方法对修饰的DNA探针纯度要求较高，分离纯化操作繁琐。通常将生物素修饰于DNA/RNA链，亲和素通过共价偶联或静电作用连接于传感器电极表面，利用生物素与亲和素之间极强的专一亲和作用，将DNA/RNA固定在电极表面。该方法固定DNA/RNA较为简便、高效。
共价结合法是通过形成共价键，如酰胺键、酯键以及醚键等使DNA/RNA固定到传感器电极表面。
基本原理与化学交联法相似，即首先将传感器表面进行活化预处理，引入所需的活性基团，如羟基、羧基或氨基等；其次对DNA/RNA进行衍生，使其带上合适的官能团；最后用双官能团试剂或偶联活化剂连接支持电极与衍生后的DNA/RNA。 | 
/3 
浙公网安备33010802005999号 
