IVD科技丨用干血斑取样助力偏远地区HBV检测和测序分析

世界卫生组织（WHO）估计，全世界有2.57亿人长期感染乙型肝炎病毒（HBV）。一旦慢性感染发展为更具攻击性的疾病，如肝硬化和肝细胞癌（HCC），就需要进行早期诊断和治疗，以降低死亡率，防止HBV长期并发症，并避免病毒传播。正因为如此，世卫组织建议增加获得诊断的机会，以此作为减少新感染人数的关键，从而防止数百万人死亡。

分子检测，如HBV定量和测序，有助于HBV诊断。通过量化血清或血浆中的HBV DNA来评估抗病毒治疗的结果。分子检测对于基因分型、耐药性和疫苗逃逸菌株的监测、抗病毒治疗的不依从性和其他可能性也很重要。然而，商业分析通常很昂贵，因此在低收入环境中不易获得。此外，血清样本的使用可能会成为难以接触人群（如老年人、儿童、吸毒者和偏远地区居民）分子研究的障碍。在所有这些情况下，干血斑（DBS）样本可能是一种简单、经济且侵入性较小的替代方法。研究表明，HBV DNA可以在DBS样本中检测和定量。DBS的使用有一些优点：手指穿刺可以提供少量血液；DBS易于收集，只需最少的培训；该样品在室温下稳定，便于从偏远地区运输到实验室进行检测，甚至可以通过邮件发送样品。

在分子流行病学研究中使用DBS，更好地了解基因型和病毒突变在乙型肝炎过程中的作用，对于在没有金标准方法的环境中推广获取HBV多样性的方法至关重要。一旦大多数HBV慢性感染者生活在偏远地区，进行病毒诊断的实验室基础设施有限，获得经济和准确的诊断方法是根除HBV的关键步骤。

近日，来自巴西的研究团队在Scientific Reports上发表了一篇题为“Dried blood spot sampling for hepatitis B virus quantification, sequencing and mutation detection”的文章，在这篇文章中，评估了DBS在使用内部技术检测、量化和测序HBV DNA方面的应用。包括两个研究组：92名HBsAg+个体和49名阴性对照。研究团队将血清和DBS样本提交给S/pol基因的定量和定性内部PCR、测序和系统进化分析。DBS定性PCR的敏感性为75%，特异性为100%（Kappa=0.689）。DBS中的定量PCR检测限为852.5拷贝/mL（250 IU/mL），灵敏度为77.63%，特异性为100%（Kappa=0.731）。共有63份血清样本和36份DBS样本被提交测序，显示基因型A（65.08%）、D（4.8%）、E（3.2%）和F（27%），血清和DBS之间的对应性为100%。所有测序样本显示HBsAg基因多态性。总之，DBS是检测、量化和表征HBV DNA的替代方法，有可能在低收入人群中增加诊断，缩小HBV控制方面的差距。

图片来源：Scientific reports

共有141人参加了这项研究。第一组由92名HBV感染者组成，其中53名（57.6%）为男性；平均年龄为44.26±14.97岁。第2组有49名健康人，35名（71.4%）为女性；平均年龄为37.12±11.27岁。

根据HBV风险行为，两组报告经常去修指甲和共用剃须刀。然而第2组的39/49（79.6%）人提到在这过程中使用自己的镊子。另一点是安全套的使用。第一组中近40%的人在性交过程中从未使用过安全套，而第二组中这一比例为12.24%（p=0.33）。

关于合并感染，第一组有6名患者出现HBV-HIV合并感染。在第一组中，24人（26.1%）呈HBeAg阳性，69人（75%）呈抗-HBe阳性。没有患者HCV阳性。

受试者的生化和血清学特征 

图片来源：Scientific reports

采用连续稀释法评估DBS样品的线性动态范围和检测限。qPCR检测到的最低HBV稀释度为3 log10（3410拷贝/mL或1000 IU/mL）。然后，将该样品从1/2稀释至1/64，并对这些稀释液进行两次相同的qPCR。HBV DNA被检测到稀释1/4，导至HBV/mL或250 IU/mL的估计检测限为852.5份。为了评估qPCR的精密度，在同一次试验中对HBV病毒载量为4 log IU/mL（~4 log copies/mL）的DBS样本进行了20次量化，变异系数（CV）为0.73。

稀释法确定平均CT和病毒载量值

图片来源：Scientific reports

为了评估DBS样品中qPCR的再现性以及可重复性，三名操作员在三天内，每天两次，使用相同的试剂对高阳性对照组和低阳性对照组（HPC和LPC）进行测试。结果显示，该方法具有良好的再现性以及可重复性。

来自第1组（n=92）的血清样本以及DBS样本通过商业方法进行HBV定量，结果表明，与血清相比，使用DBS的qPCR的敏感性为77.63%，一致性值为86.40%，Kappa值高于0.7。第2组血清和DBS样本在商业和qPCR中均为阴性。阳性预测值（PPV）为100%（95%CI为94.26–100），阴性预测值（NPV）为70%（95%CI为57.87–80.37）。

血清和DBS样本中HBV DNA定性和定量（qPCR）检测的比较 

图片来源：Scientific reports

当比较血清和DBS之间的HBV病毒载量时，观察到血清样本中的病毒载量明显高于DBS （3.03 vs. 1.62 log copies/mL）。然而，血清和DBS的qPCR结果显示出良好的相关性（r=0.844；95% IC:0.747–0.905，p<0.0001）。

结果表明，虽然血清样本和DBS样本获得的测量结果存在差异。但是对比结果显示，商业试验中检测到的病毒载量中位数和血清学标记物如HBsAg（DO/CO值）、HBeAg和抗HBe与DBS中的HBV DNA定量在统计学上相关（<0.0001）。

血清和DBS样本中HBV病毒载量的定量分析（qPCR）。

图片来源：Scientific reports

研究团队调查了63个样本中HBV变异的遗传变异性，并评估了DBS在分子流行病学研究中的适用性。配对血清序列和DBS序列之间的比较显示出很大的相似性，从98%到100%不等。系统进化分析表明，基因型A和F最为普遍。感染病毒的个人与HBV/F感染者相比，HBV/A显示出较高的HBsAg值和较低的AST滴度（p<0.005）。关于亚基因型，在血清和DBS中，HBV/A1（57.1%）最为普遍，其次是HBV/F2（23.8%）、A2（7.9%）、F4（3.2%）、E（3.2%）、D2、D3和D4（各1.6%）。基因型A、D和F在巴西最为普遍。

具有临床相关突变的样本特征

图片来源：Scientific reports

DBS方法具有良好的可重复性，并且虽然血清样本和DBS样本获得的测量结果存在差异，但是对比结果显示，商业试验中检测到的病毒载量中位数和血清学标记物如HBsAg（DO/CO值）、HBeAg和抗HBe与DBS中的HBV DNA定量在统计学上相关。

虽然DBS有一些局限性，比如与金标准血清取样相比，DBS是一种灵敏度较低的HBV定量方法，这可能导至低估病毒载量。但是，DBS样本可用于初始筛查，然后在开始治疗前对血清样本进行第二次检测。此外，DBS还可用于评估突变，并在无法获得血清样本时用于分子流行病学研究。在低收入环境和偏远地区，金标准检测不可用，使用DBS进行分子检测可能是一种方便且经济的替代方法，增加了HBV诊断的机会，为低收入人群提供替代诊断方法。