Nature：复合纳米材料辅助泛癌诊断和分类

癌症正在成为主要的死亡原因和公共卫生问题，约占全世界所有死因死亡率的15%。对癌症进行早期可靠的诊断对于良好的预后至关重要。到目前为止，只有有限的血液肿瘤生物标记物可用，包括甲胎蛋白（AFP）、癌抗原19-9（CA19-9），和癌胚抗原（CEA），但其敏感性仍远不能令人满意。无创性筛查方案对于早期诊断是必不可少的。最近，基于血液的液体活检作为一种非侵入性和敏感的方法，在相对早期的阶段检测和定位癌症显示出巨大的前景。为此，随着许多新技术的探索，泛癌筛查吸引了越来越多的兴趣。例如，TEP（tumor-educated blood platelet）已被用于通过从全血中分离的TEPRNA测序来区分六种常见肿瘤。一项名为CancerSEEK的多分析物血浆检测依赖于无细胞DNA和循环蛋白来检测八种常见癌症。血清细胞外小泡的表面蛋白也被用于六种不同癌症的分类。然而，这些方法大多需要复杂的样本处理、精密的仪器、大量的血液样本，其准确性有待提高，限制了它们的临床应用。

之前的研究已经证明代谢组学在某些癌症诊断中的潜在应用，因为癌症被认为是一种代谢紊乱。然而，基于代谢组学的泛癌筛查策略尚未开发出来。小分子代谢物是癌症特异性信息的独特来源，因为代谢改变可以直接参与转化过程或支持肿瘤生长的生物过程。代谢组学在临床癌症研究中的应用已成为一个快速增长的兴趣领域。在过去20年中，基于质谱的方法正发挥着越来越重要的作用，使用质谱技术的非靶向定性和靶向定量方法都已开发和完善，以满足某些临床或研究需要。目前的癌症代谢组学在很大程度上依赖于一种靶向策略，在这种策略中，可以检测和识别的分子是有限的。相比之下，非靶向LDI质谱法有几个固有的优势，包括快速分析、高通量和低样品消耗。然而，LDI通常需要辅助有机基质将能量转移到分析物，由于基质中的背景离子，会影响小分子代谢物检测的准确性。纳米材料辅助的方法非常适合研究LDI的低质量范围代谢组学，其中这些纳米材料能够吸收激光能量，而不会产生复杂的团簇离子。

近日，几个来自中国和美国的研究团队在Nature communications 上发表了一篇题为“Multiplexed nanomaterial-assisted laser desorption/ionization for pan-cancer diagnosis and classification”的文章。

文章中，研究团队报告了一种用于泛癌症诊断的复合纳米材料辅助癌症识别LDI（MNALCI）方法。通过使用两种独立的纳米结构材料作为用于高灵敏度多路检测的独特基质材料，并结合用于高通量分析的机器学习，MNALCI允许对小分子代谢物低于1000 Da的信号进行高灵敏度捕获和分析。MNALCI可以从血清样本中生成代谢物的多重指纹信息，用于高保真癌症识别。MNALCI应用于1183名个体，其中包括233名健康对照者和来自两个独立队列的950名肝癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌和甲状腺癌患者。在内部验证队列中，MNALCI对区分癌症和健康对照组的敏感性为93%，特异性为91%；在外部验证队列中，MNALCI对区分癌症和健康对照组的敏感性为84%，特异性为84%，并鉴定了多达八种代谢物生物标记物。此外，在这六种不同的癌症中，在内部验证队列和外部验证队列中，识别起源肿瘤组织的总体准确率分别为92%和85%。

图片来源：nature communications

使用的第一种纳米材料是Au/SiO2核/壳纳米颗粒（GNS）。金壳生长在硅核上，通过在硅珠上吸收预合成的金并原位生长成连续的纳米壳，形成核壳纳米球。通过TEM、SEM和紫外-可见吸收光谱对核/壳纳米颗粒的形貌和光学性质进行了表征。如图1a所示，纳米颗粒的大小与裸二氧化硅纳米珠的光滑外观相比，其表面相对粗糙，这是多个金纳米颗粒种子成核和生长的结果。利用TEM-EDAX技术绘制的元素图明确证明了核-壳结构的形成，核中含有丰富的Si和O元素，壳中含有Au元素，由此估算出约17 nm的壳厚度。GNS纳米颗粒在680 nm左右的紫外-可见吸收峰也揭示了在绝缘芯结构上形成了金壳。

所使用的第二类纳米材料是使用银辅助化学蚀刻从n型硅片获得的多孔硅纳米线。在银催化的溶液蚀刻过程中，随着H2O2浓度的增加，多孔特征得以实现，这有利于小分子代谢物与增大的表面积的相互作用。通过蚀刻时间控制纳米线长度，很容易获得高密度纳米线森林。透射电子显微镜（TEM）证明了纳米线的多孔性，在5-10nm区域有不规则的孔。

由于不同纳米材料的电离/解吸过程不同，GNS 辅助的LDI在200-300 Da范围内产生更多信号，而SiNW在200 Da以下产生更多信息。

GNS 和SiNW 纳米材料的制备  

图片来源：Nature communications

研究团队基于GNS和SiNW协助LDI，建立了MNALCI，并在中国的两个医院队列中进行了泛癌筛查试验。上海队列由中国上海复旦大学中山医院1008名个体组成，其中包括203名健康对照者和805名根据美国癌症联合委员会（AJCC）诊断为I-IV期癌症的患者：肝癌（n=139）、肺癌（n=76）、胰腺癌（n=97）、结直肠癌（n=238），胃癌（119例）和甲状腺癌（136例）。合肥队列包括来自合肥安徽医科大学第一附属医院175名个体，其中包括30名健康对照组和145名I-IV期癌症患者：肝癌（n=29）、肺癌（n=28）、结直肠癌（n=30）、胃癌（n=30）、甲状腺癌（n=28）。在本研究中，合肥队列作为外部验证队列进行研究。不幸的是，合肥队列中没有胰腺癌的血样。本研究采用了特定的组织病理学类型的癌症，包括肝细胞癌（HCC）、非小细胞肺腺癌（NSCLC）、胰腺导管腺癌（PAAD）、结直肠癌（CRC），胃腺癌（GC）和甲状腺乳头状癌（PTC）。在采集血清样本之前，所有患者均未接受任何癌症治疗，包括手术、化疗、放疗等。相比之下，203名非癌症健康对照者的生化特征正常（包括血清肿瘤抗原）、超声阴性（腹部、甲状腺）、放射学（肺）和，内窥镜（结直肠、胃）检查结果，既往无任何癌症病史。

GNS和SiNW对血清样本进行的LDI检测都产生了大量峰值的丰富信息，在癌症样本和对照组之间存在细微差异,生成的复合指纹信息通过机器学习分类器进行组合和分析。上海队列分为培训队列和内部验证队列。在训练队列中，包括643名癌症患者和163名健康对照。GNS和SiNW的融合模型在93%的特异性下实现了99%的灵敏度。在特异性为93%的情况下，融合模型对多种癌症分类的总体准确率为91%，其中不同癌症类型和对照组中NSCLC的个体准确率为83%，HCC和PAAD的个体准确率为98%。为了评估MNALCI的准确性，首先使用单盲内部验证队列进行测试，包括162名患者和40名健康对照。区分癌症和健康对照，融合模型的敏感性为93%，特异性为91%，AUC为0.999。在91%的特异性下，多类癌症鉴别融合模型的总体准确率为92%，范围从NSCLC的82%到PAAD、HCC和PTC的100%。然后我们用另一个单盲外部验证队列（合肥队列）进行测试，包括145名患者和30名健康对照。融合模型的敏感性为84%，特异性为84%，AUC为0.990。在84%的特异性下，用于多类癌症鉴别的融合模型的总体准确率为85%。

MNALCI对癌症的检测和分类  

图片来源：Nature communications

除肿瘤的识别和分类外，MNALCI也提供了潜在的小分子生物标志物重要的线索。由不同m/z值簇代表的独特代谢物强调了每种癌症循环中发现的代谢组的差异。此外，通过LDI-MS/MS和LC-MS/MS，在不同癌症类型的这些顶部m/z峰中，识别并确认了8种代谢物生物标记物，即2-氧代戊酸、组胺、葡萄糖、5-羟甲基尿嘧啶、2-糠酸、甲基丙二酸、4-甲基儿茶酚和L-肉碱。这些代谢物中的大多数在其他地方被报道与癌症事件有关。在当前研究中包括的6种不同类型的癌症中，HCC、PAAD和CRC具有相对敏感和特异的血清肿瘤抗原标记物：HCC的AFP、PAAD和CRC的CA19-9以及CRC的CEA。这三种血清学标记物通常用于癌症筛查，以及手术或其他治疗后的监测。研究团队比较了MNALCI和这三种肿瘤标志物对HCC、PAAD和CRC的检测。在上海队列中，137例HCC患者中有47例（35.77%）AFP阴性（AFP<20 ng/ml，I期n=18，II期n=17，III期n=12）；94例PAAD患者中11例（11.70%）CA19-9阴性（CA19-9<37 U/ml，I期n=2，II期n=7，III期n=1，IV期n=1）；232例大肠癌患者中109例（46.98%）CEA阴性（CEA<5 ng/ml，I期n=24，II期n=35，III期n=22，IV期n=28），230例大肠癌患者中149例（64.78%）CA19-9阴性（CA19-9<37 U/ml，I期n=24，II期n=47，III期n=25，IV期n=53）。研究表明，MNALCI识别几乎所有AFP阴性HCC、CA19-9阴性PAAD、CEA或CA19-9阴性CRC。137例HCC中只有2例（1.46%）、94例PAAD中的1例（1.06%）、232例CEA CRC中的1例（0.43%）和230例CA19-9 CRC中的2例（0.87%）被误归类为健康对照组。这些结果表明，MNALCI独立于并且优于这些肿瘤标记物。

MNALCI区分每种癌症类型与健康对照组   

图片来源：Nature communications

随着癌症越来越多地被认为是一种代谢紊乱，可以认为血清代谢物谱分析是检测癌症存在的可行方法。通过将两个独立纳米结构矩阵的质谱指纹通过机器学习进行高灵敏度检测和高通量分析，研究团队报告了一种基于激光解吸/电离（LDI）质谱的液体活检技术MNALCI，用于癌症筛查和分类。与广泛使用的GC/LC-MS不同，MNALCI采用非靶向半定量质谱衍生的生化特征进行诊断。MNALCI不依赖单一生物标记物，而是利用100-1000 Da之间检测到的所有代谢物信号，主要依赖于一组代谢物的整体指纹，可以进行统计量化和比较。MNALCI的潜力在于，它能以最少的血清样本诊断和分类多达六种不同类型的常见癌症，包括肝癌、肺癌、胰腺癌、结直肠癌、胃癌和甲状腺癌。这种方法建立了一种基于微量血清的低成本、高通量程序，以高精度诊断和分类不同类型的癌症，展示了癌症诊断和其他领域标准临床实践的巨大潜力。