测序上游突围之国产生物分析仪，加速测序全流程国产化

图1.不同平台二代测序流程。

FFPE样本中提取的gDNA一般会从浓度、纯度和片段完整性三个方面进行质控。浓度和纯度可以通过EzDrop 1000超微量分光光度计这类仪器进行质控，提供核酸样本的A230、A260和A280数据，然后通过A260/230和A260/280的比值来判定样本的纯度。对于DNA样本，A260/A280为1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/A280<1.6，说明有蛋白质或酚等污染；A260/A280>2，说明RNA没有除干净或DNA已变性。对于RNA样本， A260/A280为1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/280＞2.0则说明RNA可能已经存在降解；A260/280＜1.8则说明有蛋白质或其他杂质残留。

图2.Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）

FFPE样本的完整性质控方面，则可以通过Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）完成。

Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统，又称生物片段分析仪，全自动毛细管电泳仪。2016年，中国台湾光鼎在江苏成立合资公司江苏光鼎，完成了NGS质检仪器国产化生产，且产品已获得医疗器械注册证。至此，Qsep设备耗材可由光鼎江苏分公司直接供货，为广大生物分析仪的使用者带来前所未有的便利。

通过计算基因组质量评分DQN（DNA Quality Number），可以高效地评估gDNA的质量。由Qsep开发的片段分析仪，其数据分析软件可评估每个样本与用户定义的特定应用阈值用于“高质量的DNA”评分，并指定0到10之间的DQN值。数值反映高于定义的阈值的DNA的百分比。

对于FFPE提取的gDNA样本，Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统软件具有基因组DNA质量评分值（DQN）系统，可以高效评估FFPE基因组样本质量。可为样本库中评价核酸的质量标准提供数字化的标准。

图3.不同质量gDNA样本DQN值比较（FFPE提取），左图：DQN:7.2，右图：DQN:9.9。

Qsep全自动核酸蛋白分析系统有两个指标可用于评估RNA的质量。首先是软件计算RNA质量评分数值RQN（RNA Quality Number），RQN值范围为1到10， 是基于专有的计算算法，考虑RNA电泳图谱的整个分布。

图5.total RNA样本梯度稀释结果。

虽然RQN值是从新鲜组织分离的RNA质量的可靠质控标准，但它们并不是福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）样本的RNA质量的准确质控评价手段。为了解决这个问题，Illumina的科学家开发了DV200检测标准，可以计算RNA片段大于200nt大小的百分比。考虑到DV200值和二代文库产量之间的更强的相关性，与RQN值相比，DV200评分体系对于评估FFPE RNA质量是更为贴切的。Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统可以直接提供不同样本的DV200的数值。

图6.不同质量Total RNA样本DV200值比较（FFPE提取），左图：DV200：54.6%，右图：DV200：78.3%。

结合Qsep提供的DQN值可判断是否可进行建库。根据不同大小的DQN数值也可设置不同的打断条件，以期获得稳定的符合预期的片段大小，将片段化后的样本按照标准流程进行文库构建，利用Qsep仪器可以分析文库片段大小的分布范围是否符合建库的要求（见图7）：左侧是一个正常的打断文库，右侧文库在打断中，没有打断彻底，导至文库整体片段偏大，不建议继续进行下一步验。

图7. 不同文库比较，左图：正常文库，右图：片段偏大文库。

图8.文库片段分布分析。

在上机前文库质控中，可通过Smear分析确定文库的主要片段分布区域，以及其平均片段长度。

在整个二代测序过程中，无论是对核酸的质控还是对文库打断样本和上机前文库的质控，Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统可以为用户更简便，更准确地提供对应的数字化质控数据，为后续的高质量的测序数据提供保证。

近年来，国产测序设备企业奋力直追，积极布局，国产设备逐渐兴起，并在国内占据一定的市场份额。Qsep作为国内同类产品领跑者，已经与国外产品达到同一水平甚至有所超越。Qsep致力于更加灵活的通量、更简单的操作、更短的时间与更低的成本，为中国的测序前处理质控环节提供了强有力的支持和自信心。

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