各具特色的中外手持式PCR仪
2022-1-17 09:58|
编辑: 归去来兮|
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摘要: PCR作为一种高通量核酸分子检测方法，早已名声在外。其在使用过程中，多以体积较大的PCR仪为主，检测试剂也需配合样本前处理方法进行使用，对操作人员和产地要求相对较高。但伴随着技术进步与市场需求，流水线工作站 ...
| PCR作为一种高通量核酸分子检测方法，早已名声在外。其在使用过程中，多以体积较大的PCR仪为主，检测试剂也需配合样本前处理方法进行使用，对操作人员和产地要求相对较高。但伴随着技术进步与市场需求，流水线工作站、一体化检测系统近年来日渐红火，PCR仪也被作为模块之一整合至全流程检测系统中，但这种设备的占地面积通常较大，适用于大样本的批量检测。而新冠疫情之后，分子POCT甚至于家庭自检产品开始崭露头角，设备小型化、检测时间短、操作更简便的产品，一直为大家所期待。特别是基于PCR技术的便携式产品，其不仅在技术原理上更加为人所接受，应用范围的拓展空间也更加宽广。而手持式PCR仪的出现，正是为便携式变温检测系统的一种诠释。
Visby Medical Inc成立于2012年，其开发的无仪器、一次性PCR试剂，可随时随地按需检测，快速获取结果。该平台开发的新冠检测试剂获得FDAEUA，授权于实验室检测使用（非居家自检），其检测性传播疾病的试剂也已获得了FDA许可和CLIA豁免，用于检测沙眼衣原体、淋病奈瑟菌和阴道毛滴虫Visby Medical产品是一款一次性使用的一体化检测卡，操作过程相对简单，大致包含以下步骤：③关闭样本孔盖，并依次按下检测卡的1、2、3号按钮；Visby Medical检测卡的工作流程如下图所示，总体上与核酸分子检测流程无异，同样包含样本处理→核酸扩增→产物检测，对应检测卡中的样本制备模块、放大模块和检测模块。在使用时，当样本加入检测卡后，需手动依次按下按钮1→2→3，此时便启动了样本的输入处理步骤，使得样品通过过滤器被截留捕获，并依次经过洗涤和洗脱步骤，从而获得目标样品，再将其送入灭活室中。灭活室中包含加热器，可使酶失活或裂解释放核酸。裂解释放的样品再被输送至混合室中，与扩增试剂原料混合，并被驱动进入放大模块，执行PCR程序。对于RNA样品，在PCR之前可接入RT模块（图中未画出），以便RNA逆转录成cDNA。扩增后的产物再进入检测模块，与试剂反应，显示结果。其中，在核酸扩增过程中，该检测卡使用了连续流PCR(continuous-flow PCR)。从其放大模块可以看到蜿蜒回旋的形状，对应回路中形成的不同温度带，如图中弯曲部分为低温退火/延伸区，中间部分为高温变性区。PCR反应溶液在流动的过程中，先经过高温预变性区域，再进入循环扩增区域；在循环扩增区域，往复流经变性-退火/延伸区，使得核酸在不同温度区域中实现扩增。当流经整个扩增区域后，则完成了40个循环的扩增过程。其检测方法采用核酸杂交捕获和酶催化显色反应。带有生物素标记的引物，与靶标核酸结合扩增后，使得扩增产物带上生物素标记；该产物进入检测模块后，可与包被在检测区域的互补探针杂交，从而被固定；最后标记有链霉亲和素的酶（如辣根过氧化物酶）与生物素结合，从而形成固相载体-捕获探针-扩增产物-酶复合物；而酶则可催化底物显色，实现结果判读。该产品为一体化的一次性检测卡，无需额外配备PCR仪器，可随时随地按需进行测试，用完即弃。Mesa Biotech成立于2009年，2021年被赛默飞收购，其研发的流感A/B型和呼吸道合胞病毒(RSV)已获得美国FDA的510(K)许可和CLIA豁免，新冠检测试剂也获得FDA EUA（非居家自检）。Mesa Biotech检测卡盒需配合其检测基座使用，检测卡为一次性使用，其使用方法大致如下：④撕开检测卡加样孔上的铝箔膜，并用滴管吸取样本加入检测卡中；⑥30分钟后完成检测，取出检测卡，观察检测卡的结果窗口，判读结果。Mesa Biotech检测卡的靶标微流控部件包含样品输入、裂解、逆转录、扩增和检测五个腔室。样本通过样品输入腔室进入裂解腔室后，在化学试剂或加热条件下裂解释放核酸，再分别通过逆转录和PCR扩增。其中扩增反应为不对称PCR，可产生单链扩增产物，以便后续的核酸杂交检测。扩增后的产物在进入检测腔室后，与检测试剂混合，并进行侧向层析，最后结果可在检测条带中显示。检测卡预装的试剂储存在试剂凹槽位置，可为液体或冻干试剂。当样品由上一个腔室流经下一个腔室时，先通过试剂凹槽与试剂混合，再执行后续的反应过程，如试剂凹槽15预装逆转录原料，则可在第一腔室进行逆转录反应。Mesa Biotech检测卡采用PCR+免疫层析相结合的方法进行检测，扩增后的核酸产物进入检测腔室时，可与检测颗粒混合使得待检测靶标核酸带上标记，且在检测条带层析过程中，可被检测探针捕获，从而在检测区域显示结果。另外，单个检测条带上可使用多个捕获探针，从而实现多个扩增子的多重检测。同时，检测卡也可设计为并行的多腔室，以实现反应的多重检测。基座可重复使用，相当于一台小型仪器；检测卡为一次性使用耗材，样本配合其专用采样管加入检测卡后，进行简单的热裂解处理。3.Nippon Sheet Glass Co., Ltd.日本板硝子株式会社(Nippon Sheet Glass Co., Ltd.)是一家全球知名的玻璃制造商，结合其创新技术开发了一款紧凑、快速、轻便的移动实时PCR装置PicoGene，该设备可以在现场快速识别各种类型的基因，因此有望用于工厂食品卫生、环境污染调查和生物勘探等广泛领域。日本板硝子株式会社(Nippon Sheet Glass, NSG)的Mobile Real-Time PCR device（PicoGene™ PCR1100E）操作比较简便，总共只需三步：③按下“开始”按钮启动测试，根据项目不同，可快至10分钟获得结果，以实时荧光扩增曲线的形式展示。该产品目前仅用于科研使用，从其公布的信息上看，对样本处理过程的描述较少，可能是直接加提取纯化后的核酸，或是对样本的处理较为简单，如免提取、加热裂解等简单处理。其核心技术是基于NSG技术储备开发的微流控芯片和荧光检测系统。其中在PCR循环扩增时，通过在左右两端分别设置高温区和低温区，使得样品通过微流道在两个温度区域来回切换流动，实现PCR的循环扩增程序，同时在样品流动过程中采集荧光信号，形成实时荧光检测信号，以对检测结果进行判读。如同手机式的PCR仪，内置电池，可自由移动，检测结果为实时荧光PCR扩增曲线。北京中科生仪科技有限公司成立于2009年，公司侧重于便携式核酸分子检测设备、实用化POCT设备、基因测序技术及装备，以及相应的配套试剂产品等原始创新研发和产业化工作，目前处于研发阶段的产品线包括：现场级核酸提取与定量PCR一体化系统；手持式核酸等温扩增系统；数字化PCR系统；手持式阵列传感器电子鼻系统；手持式高精度肺功能检测系统；高通量半导体基因测序系统等。中科生仪的手持式PCR仪器“CarryOnP1000Q”搭配其检测芯片使用，操作过程简单，大致为：①利用拭子采集样本后，可将拭子头直接折断在检测芯片加样孔中，并拧上盖子；④打开仪器盖子，插入检测芯片，再盖上盖子，点击运行检测；⑥大约40分钟后，检测结束，可查看实时荧光扩增检测结果。中科生仪的“CarryOnP1000Q”是一款集合了核酸提取、纯化和扩增的便携式检测装置，其检测芯片预装的试剂，在样本导入后，配合仪器可完成从样本处理到结果输出的全流程。其中样本处理过程中采用了超声振动+磁珠吸附，并配合时间矩阵，使得样本处理时间缩短，提高实验效率。纯化后的核酸在泵阀驱动下，进入扩增仓反应。在执行扩增反应时，仪器温控系统配合芯片结构，对反应温度进行调控，确保扩增反应快速进行，并在预设温度范围内对扩增信号进行采集，最后当反应结束后，散热单元对芯片进行完全散热，以便快速更换芯片进行新一轮的检测。流程集成化，操作简单化，一步加样后，可由芯片完成核酸提取、扩增和检测过程；仪器内置电池，可持续供电3.5小时，检测结果可通过蓝牙、WiFi或4G等无效通讯模块无线传输。小型化、便携式的设备，其通量通常较小，以上列举的手持式PCR仪单次测试均只能检测一个样本。因此，小型化设备，特别是核酸分子检测产品，其在产品开发过程中就应该找准定位、明确应用场景，脱离实际使用场景的产品，终会被市场淘汰。在明确定位后，产品开发的要求可能也更高。对于这种手持式PCR仪，需要在保证结果的前提下，使其操作过程更加简洁人性化，运行时间更短，甚至续航能力更长，这样才能契合产品的定位。再者，便是成本控制问题。这种集成化、一体式的检测产品，其试剂和耗材成本一般均较高，如何在产品研制成功后，进一步降低检测卡的生产制造成本，或许也是企业的一个难点。
参考资料 [1]各公司官网.
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