| 逆转录（Reverse Transcription）是以RNA为模板，在逆转录酶的催化作用下，合成RNA/DNA杂合双链，然后水解杂合双链中的RNA，得到互补的单链cDNA的过程。得到的cDNA单链可以作为扩增模板，合成双链DNA。cDNA的合成可以用与后续的PCR实验、qpcr实验、基因检测、基因工程等各个领域。
图1：逆转录PCR的流程图 逆转录实验成功的要素包含：逆转录酶、主要反应组分、引物的选择、gDNA去除等。 1.逆转录酶 大多数逆转录酶，主要包括以下三种活性： ①逆转录活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合，生成DNA-RNA杂合双链。 ②RNase H活性：水解杂合双链中的RNA，得到与RNA互补的DNA单链（cDNA）。 ③DNA指导的DNA聚合酶活性:以cDNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成双链DNA。 常见的逆转录酶包括AMV和M-MuLV逆转录酶，M-MuLV逆转录酶具有更高的热稳定性，并且降低了RNase H的活性。 表1：野生型M-MuLV和野生型AMV两种逆转录酶性能对比
2.单价阳离子 离子条件基本上影响各种模板的转录效率。K+的转录产物比Na+较长。对于cDNA长度的最适K+浓度为140-150 mM。 3.二价阳离子 对于反转录酶活性来说，二价阳离子也是必需的。产生全长cDNA产物的最适浓度是6-10 mM。 4.dNTP 四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)的浓度，对于有效合成cDNA是至关重要的。如果其中只有一种的浓度小于10-50 μM，cDNA的产量将明显下降。常用的dNTP的浓度为200-500 μM。 5.引物的选择 逆转录引物一般包含三种：oligo dT，随机引物（Random Primer Mix）和基因特异性引物（GSP）。客户可以根据个人需求进行选择。 表2：三种逆转录引物优劣势对比
6.gDNA去除 污染性gDNA可能会干扰逆转录反应，并导至后续的PCR实验、qPCR实验结果出现假阳性、高背景或检测率降低等现象。通常在RNA提取过程中加入合适浓度的DNase I，37 ℃加热10~15 min，去除gDNA干扰。 信息来源：Super Lab |
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