多重qPCR的小bug：通道间的荧光干扰现象

    以前的临床检测，qPCR主要以单重检测为主，通常是FAM为目的基因的检测通道，VIC为内标，再加上ROX染料。随着新冠病毒的ORF1ab和N基因双基因检测和非洲猪瘟病毒的P72、CD2V和MGF三基因检测，多重荧光检测越来越多的应用于临床中。多重荧光qPCR与单重qPCR比起来，优点是又方便又省力，有什么不足呢？先卖个关子。

一.一次偶然的实验

    目前最主流的三重荧光qPCR通常使用 FAM、VIC/HEX、Cy5这三个通道，本次实验使用的试剂盒也是这三个通道。

1.三重荧光qPCR实验

    一个偶然的机会，一个实验员使用某三重荧光qPCR试剂盒对标准物质进行3个浓度的10倍被比稀释实验，阴阳性对照、质控都成立，结果如下：

FAM通道的扩增曲线：

VIC通道的扩增曲线：

Cy5通道的扩增曲线：

实验员结论：FAM、VIC通道样品阳性且线性良好，Cy5通道样品阴性。似乎没什么不妥。

2.三重荧光qPCR实验的复现

    笔者又在不同的实验室、不同的实验人员使用不同的qPCR仪和试剂盒重复以上试验，稀释度由3个增加为5个，阴阳性对照、质控都成立，结果如下：

FAM通道的扩增曲线：

VIC通道的扩增曲线：

Cy5通道的扩增曲线：

实验员结论：FAM、VIC通道样品阳性且线性良好，Cy5通道样品阴性。

这个实验又在第三个实验室、不同的实验人员使用不同的qPCR仪和试剂盒重复以上试验，阴阳性对照、质控都成立，结果和前两次实验一致。

二、无中生有的VIC荧光

    在大部分的检测流程中，实验结果出来后看一下阴阳性对照和质控是否成立，如果成立再看一下结果中有无Ct值和扩增曲线，如果既有Ct值扩增曲线又比较正常就可以出具检测报告了。如果按照这个流程走下来，结论一定是：FAM、VIC通道样品阳性，Cy5通道样品阴性。但是在这个案例中，样本中只含有FAM通道的模板，没有VIC和Cy5通道的模板。通常情况下针对单一模板使用单重的qPCR方法检测就可以了，这次一个偶然的机会，实验室使用了一个三重荧光的试剂盒检测单一通道的模板，才让我们发现了VIC通道出现荧光干扰的情况。

    出现这种情况最大的可能是FAM和VIC/HEX荧光波长比较接近，两个通道间存在一定的荧光干扰。Cy5与FAM VIC波长差异较大，未发生荧光干扰。其实这样的误判是可以避免的。

三、进行多重荧光qPCR结果判读的正确姿势

1.先看所有通道的扩增曲线

三个通道全部打开的扩增曲线图如下：

第一次实验：

第二次实验：

对于第二次实验的扩增曲线几乎看不到VIC通道的扩增曲线，这种情况很容易判定VIC的扩增曲线为假阳性。但是对于第一次实验的结果，我们很难确定VIC的扩增曲线为假阳性，因为我们不知道该试剂盒的设计是不是VIC通道的值就是比较低。

2.看原始荧光强度

    由于荧光信号强度在各仪器的显示单位各不相同，不同仪器间无法相互比较，在此呼吁各仪器生产厂家能将荧光强度溯源到相同的国际单位，使得荧光强度也具有计量溯源性。

第一次实验纵坐标直接就是荧光强度，将原始结果导出后如下：

第二次实验荧光强度数据需要另外导出：

第一次实验的FAM荧光普遍比VIC荧光强度高10倍，第二次实验FAM荧光普遍比VIC荧光强度高100倍，对于如此大的差异就需要谨慎一些了。

3.看每个通道的扩增曲线

扩增曲线需要为特异性扩增曲线。见一、1.三重荧光qPCR实验和一、2.三重荧光qPCR实验的复现。

4.看Ct值

本实验最大的特点是FAM和VIC通道的Ct值十分接近，两者Ct值之差不超过±1，但是扩增曲线的荧光强度却相差10倍甚至100倍，出现这种现象时就需要格外注意了。

5.复核

    如果对结果仍无法确认，最好使用单重qPCR试剂进行复核，继续使用多重试剂关掉其他荧光通道，只开一个荧光通道是没用的，因为仪器仍然会采集全部通道的荧光信号，我不选FAM通道只留VIC通道仍然有扩增曲线：

6.荧光干扰的决定因素是什么

我至今仍无法确认发生荧光干扰现象会发生在哪些品牌的qPCR仪或者某些品牌的哪些型号的qPCR仪。网友们可以测试下你所用的仪器，然后公众号中留言告诉我。

四、多重荧光qPCR试剂盒的不足

1.荧光通道间的相互干扰

上文所述。

2.多重qPCR的LOD

单重qPCR试剂的LOD很容易就能达到1 copie/μL，但是经过我的评估，三重qPCR很难做到所有通道都达到1 copie/μL，越多重难度越大，因此多个通道中的某些通道容易出现假阴性（漏检）的结果，不同通道间有差异时就很难对结果进行合理的解释了。

3.设计难度大

多重不是简单的多个单重的合并，而是需要对引物探针进行重新设计，筛选适合多重反应的体系，同时要避免交叉反应，非特异扩增还需要使各通道间的荧光强度比较接近，好的多重qPCR产品还是需要试剂厂家下功夫去开发的。

个人能力有限，有些问题无法凭一己之力解决，真心希望试剂公司、仪器公司、计量机构能够倾听一下检测中的需求和困难，大家共同努力去解决这些难题。