常见分子病理检测平台的特点及其选择

近年来，随着分子病理诊断技术及靶向药物研发不断进步，非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer, NSCLC）肿瘤患者个体化靶向治疗获得了长足进展，显著提高了患者术后无进展生存时间，生活质量也稳步提高。因此，传统的以形态学为基础的组织学观察等技术已无法满足精准医疗的需要，选择准确、快速、价格具有优势的基因检测方法，开展精准分子病理诊断对临床医师选择合适靶向治疗方案具有重要意义。

我国NSCLC患者的分子病理特征与国外人群有所区别。其中，肺腺癌常见的变异基因包括表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR，45%-55%）、KRAS（8%-10%）、间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK，5%-10%）^[1]。其中，EGFR在NSCLC患者肿瘤组织中具有高频突变，针对其突变的吉非替尼等酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKIs）已获批上市并在临床治疗中取得良好预后。

除上述高频突变外，NSCLC患者还常检出少见变异基因，包括ROS1（2%-3%）、MET（2%-4%）、HER2（2%-4%）、BRAF（1%-2%）、RET（1%-4%），以及罕见变异基因NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）、FGFR2（<1%）等^[1]。虽然上述基因变异在NSCLC中的意义仍有待进一步明确，基于上述少见变异的靶向治疗药物研发仍然有机会为部分NSCLC患者提供靶向治疗依据。因此，围绕上述NSCLC中的常见突变，选择合适的分子病理检测方法是当前NSCLC病理诊断中的重中之重。

针对上述NSCLC中的分子基因改变，分子病理常见的检测方法包括免疫组织化学方法、荧光原位杂交技术(FISH)、ARMS-PCR技术、数字PCR技术、二代测序（NGS）技术等。尽管近年来，NGS技术由于通量高、灵敏度高等优势受到广泛关注，是分子病理检测发展的主要方向。但短时间内，检测价格较高、平台要求较高、实验与报告解读人员资质要求等限制了NGS技术推广。因此，针对不同需求，除NGS之外的检测平台均具有不同的优缺点，同时与肿瘤基因突变类型、突变基因丰度、样本质量、实验室条件等多种因素有关。应用上述两种或多种检测技术共同诊断有助于结果互补及验证，具体介绍如下：

免疫组织化学染色在分子病理诊断中应用较少，但是其作为上述方法中，唯一能够检测蛋白表达水平的方法具有重要意义。除此以外，免疫组化作为病理科常规技术，操作简便，应用普及，配合形态学分析与蛋白定位，如利用免疫组化检测HER2基因扩增检测在乳腺癌分子分型中已成为常用技术。在肺癌中，ALK突变及融合通过免疫组织化学诊断能够有效确认ALK重组蛋白存在，是ALK基因变异分子病理诊断的可靠标准之一^[2,3]。免疫组化技术适宜于石蜡包埋的组织蜡块、细胞蜡块以及细胞涂片等。但与传统免疫组化技术类似，其主要缺点为结果判读依赖医师主观经验，假阳性率高，仍需进一步配合其他分子病理技术验证。

荧光原位杂交技术（FISH）在基因断裂重排检测中具有重要意义。如利用FISH技术在DNA水平检测MET扩增已成为MET分子病理检测金标准。检测结果判读直观，对样本质量要求低。但该检测中，FISH判读对病理医师要求较高，在应用时推荐联合其他平台如qRT-PCR及测序技术复检。此外，FISH技术在特定检测中，如ALK/ROS1重排等分子基因改变检测中具有重要作用^[2,3]。FISH技术适宜于甲醛固定的石蜡包埋标本、细胞学标本。

在PCR技术的基础上，突变扩增系统((amplification refractory mutation system, ARMS)技术针对已知基因突变，设计不同引物，其3′端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来，从而结合PCR或qPCR技术完成点突变检测^[2-4]。ARMS-PCR技术灵敏度更高，操作简单，污染风险低，检测快速，成本低，市面上已有大量成熟商品化试剂盒提供，如肿瘤靶向用药EGFR基因检测，NMPA批准的检测试剂盒，绝大部分都是ARMS检测方法，是目前院内开展基因检测的首选平台。但ARMS-PCR同样具有通量较低、不能检测未知突变的缺陷，且其引物高要求不适用突变位点GC含量偏移的SNP检测。目前ARMS-PCR有NSCLC单基因、多基因联检检测试剂盒，已被国内外医疗机构广泛推荐使用。

数字PCR，即Digital PCR(dPCR)是一种核酸分子绝对定量新型技术，相较于qPCR，其优势在于能够直接获得DNA分子的拷贝数，实现样品中核酸绝对定量，减少内参误差^[4]。与普通PCR技术相比，其优点为检测限更低，但同样不能检测未知突变。数字PCR是目前检测下限最高的平台，适宜检测血液含量低的ctDNA中多种突变类型，如点突变、扩增。2018年《中国临床肿瘤学会（CSCO）原发性肺癌诊疗指南》推荐的EGFRT790M突变检测方法中，血液检测可作为组织学检测的有力补充（2A类证据），并推荐可用AMRS-PCR，以及灵敏度更高的数字PCR。数字PCR作为指南推荐的检测技术方法之一，能够有效克服液体活检中常见的ctDNA含量低、降解严重，以及存在PCR抑制剂等问题，其高灵敏度的优势在液体活检领域大放异彩，而近年来一系列研究也对数字PCR的检测能力予以肯定。

高通量测序技术，又名二代测序(（Next Generation Sequencing，NGS）是目前市场上基因检测应用最广泛的检测平台之一。二代测序是一个强大的功能平台，它可以同时给数以万计的DNA分子进行测序。由于这种可以多个样本同时测序的能力，在个性化医疗、遗传疾病和临床诊断等方面，二代测序也就是高通量测序开创了革命性的领域。其特点是能够同时对成千上万个基因进行定性定量的测序检测，覆盖点突变、插入/缺失、重排、扩增等多种变异类型。目前最常见的二代测序平台包括Illumina、BGI（华大基因）、Life等，各家测序原理均有所不同。除实验操作之外，二代测序数据下机后对生物信息学分析部分也具有较高要求。包括测序后数据的质量分析、比对、变异识别、基因注释、结果报告与解读分析等。相较于传统测序技术，二代测序通量高，信息量丰富，能够鉴定罕见位点，且相对成本更低。但其检测周期相对较长，同时后期数据分析对分子病理从业人员提出了更高要求。推荐对有条件的初治患者使用二代测序对NSCLC的所有必检和扩展靶点基因进行筛选，对于EGFRTKI耐药患者也推荐二代测序检测以全面地查找耐药原因。但是，需认识二代测序的不足，必要时可使用其他单基因检测或多基因联合检测的方法并用或验证，尤其对于二代测序检测结果全阴的样本。如DNA二代测序检测结果驱动基因阴性的样本，可以使用其他检测方法在RNA或蛋白水平复检，以保证全面地检出靶点基因变异^[1]。

NSCLC发病率逐年升高，其中肿瘤基因突变鉴定诊断对NSCLC患者预后及靶向用药具有重要意义。NSCLC检测应根据样本、适用检测方法等，综合考虑患者就诊时间和疾病进展情况，为初测和复测的患者选择适宜的检测策略，才能给临床治疗决策提供最大程度的帮助。优先推荐多基因联合检测，如ARMS-PCR；高通量基因检测是未来发展方向；在组织标本不足、医院条件限制等情况下，可首选单基因检测。应用上述不同检测方法，在评估不同患者诊疗过程中，包括时效性、基因数目、样本质量等因素综合考虑，能够为NSCLC患者分子病理诊断及靶向治疗提供更多帮助。

参考文献

1，非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）。中华病理学杂志，2021, 50(4):323-332。

2，Mitsudomi T, Morita S, Yatabe Y, et al. Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harboring mutations of the epidermal growth factor receptor (WJTOG3405): an open label, randomized phase 3 trial[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(2): 121-128. DOI: 10.1016/S1470-2045(09)70364-X.

3，Pennell NA, Arcila ME, Gandara DR, et al. Biomarker testing for patients with advanced non-small cell lung cancer: real-world issues and tough choices[J]. Am Soc

Clin Oncol Educ Book, 2019, 39:531-542.

4，中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家共识. 中华病理学杂志, 2011, 40 (10):700-702.

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