诊断技术｜在设计诊断用抗体时，需考虑哪些因素？

当下，需要检测的分析物范围不断扩大，从非常不连续的小分子（aptens），到较大的大分子，甚至整个细胞，都开始需要检测。

因此能够有效处理样品并报告样品生物物理指标的仪器被广泛使用，这促进了许多分析平台的自动化、小型化和高通量。

无论技术平台如何，识别分析物的性能是最关键的性能差异因素。

抗体是无处不在的（生物）识别分子，已经反复证明了它们对各种分析物的功效。

对抗体的依赖仍然是诊断学中的一个关键范式，重要的是要理解为什么以及这些分子如何有效地满足当今的诊断挑战。

免疫分析工具箱中最成熟的方法之一是利用动物的自然免疫反应，让其接触感兴趣的分析物。

通常情况下，这涉及到纯化指定的蛋白质目标分析物，如来自细菌细胞的致病性标志蛋白，或来自血清或肿瘤细胞表面的癌症生物标志物，并将其注射到动物体内，通常在有辅助剂的情况下。

在这种初级免疫之后，在几周到几个月的时间里，对动物进行间歇性强化，以利用体内的亲和力进行成熟。

重组技术现在可以通过异源表达生产蛋白免疫原，从而避免了培养大量临床材料的需要和处理这些材料的风险。

DNA免疫是另一种重组技术，它绕过了表达和纯化步骤，通过与宿主动物的翻译机器合作，在体内产生目标蛋白。这种最初的“prim”通常与随后的纯化抗原的“boost”一起进行。

触媒（低分子量的分子，如药物）通常需要与较大的载体蛋白结合，如锁孔虫血蓝蛋白（KLH）、牛血清白蛋白（BSA）或牛甲状腺球蛋白（BTG），以便它们能被免疫系统有效地“看见”并有效地吸引T细胞。

同样，多肽也可以与载体蛋白结合，用于激发免疫反应。然而，尽管这种策略是成功的，但必须认识到，共轭的肽是人工的，不一定能忠实地代表肽的原生环境，特别是当肽代表一个大分子中的表位，表现出层次结构的复杂性时。

传统上，血清来源的多克隆抗体和杂交体来源的单克隆抗体已经被证明是这种试剂的主要来源，然而，这两种类型的抗体在其绝对的诊断效用上是有限的。

例如，多克隆抗体必须从被免疫的动物身上连续采集和分离出来，批次的异质性是一个主要问题。

同样，由于其多克隆性和固有的异质性，除非引入二次纯化步骤，否则确实存在产生交叉反应的可能性。

使用B细胞永生化或杂交瘤技术生产的单克隆抗体因其真正的单特异性而更胜一筹，它可以被用来检测特定类别甚至是独特的分析物，如在主要的非致病属背景下的致病性细菌细胞。

然而，由于它们主要针对病菌，保守的哺乳动物蛋白经常被证明对这样的抗体产生方法有困难。

一旦获得足够的抗原特异性血清滴度，多克隆群体被适当地富集，B细胞群体被适当地偏向，这就为分离和永生化一个稳定的B细胞候选者提供了免疫学上的保障。

尽管这是一项非常强大的技术，但重要的是要意识到这确实是一个数字游戏，而且所得到的基本上是免疫复合物的一个快照。

现在有可能通过使用PCR特异性扩增V基因和创建重组V基因库来常规地捕获免疫动物的整个可变（V）基因库。因此，这种策略记录了抗原驱动的体液反应的全部内容，而不是一个快照。

然后，通过用灵活的连接序列合成VH和VL结构域，就有可能重现片段变量（Fv）的配对。

在这一点上，将各种抗体结构域看作是模块化的实体是很有用的，然后可以理解到将这种最小化的单链Fv（scFv）结构重新组合成一系列的替代结构（图1），从二聚scFv到Fab，甚至是完全逆向工程的IgG。

重组组合过程的随机性可以导至scFv具有全新的特异性和亲和力。

图1|典型的IgG和模块化重组抗体格式的代表性迭代。一个IgG分子大约是150kDa，由两条重（H）和两条轻（L）多肽链组成（如图所示），通过二硫键连接在一起。IgG是一个“Y”形分子。Y的两个臂由可变重区（VH）和可变轻区（VL）组成，包含抗原结合位点，一起被称为Fv部分（如图）。IgG还由常数（C）区组成，常数区决定了抗体的同型性，对免疫系统的信号传递很重要。单链片段变量（scFv）由VH和VL区域组成，它们的末端由灵活的甘氨酸-丝氨酸（Gly4Ser）3连接体连接。一个单链抗体（scAb）由Fv区组成，拴在VL区的是人类恒定κ轻链。一个片段抗原结合（Fab）（或片段抗原结合分子）由一条完整的轻链组成，通过二硫键与VH和CH1链连接。双抗体是一种双特异性重组抗体分子，由两个Fv分子通过灵活的Gly-Ser连接体连接而成。

通常情况下，来自免疫动物的重组scFv库是107~1010个独立的转化体，这通常是足够的。

在最后一次增殖后，收获主要的淋巴器官（如脾脏和骨髓），提取RNA并进行反转录，得到cDNA模板，从中扩增出V基因谱。

外周血淋巴细胞也可用于构建文库，在不可能切除淋巴器官的情况下，事实上，更经常的是优先用于构建非免疫图书馆。

后一种情况是利用了动物的天然免疫复合物，因为动物没有系统地接受任何专门的免疫方案，尽管实际的天然程度将取决于特定动物的年龄、免疫能力和暴露于环境抗原的程度。

为了增加多样性，最好是准备一个由多种动物的代表性克隆复合物组成的集合纯合库。原始库的明显优势是，一旦建成，它们基本上就代表了一个通用的架子库，可以随时筛选任何目标抗原。

免疫和库构建之间的时间差被消除了。此外，高毒性的抗原也可以被轻易地筛选出来。然而，天然抗原的后果是，体内的亲和力成熟事件被绕过，因此，克隆体经常返回具有较低亲和力常数的抗体。