PCR技术自20世纪80年代问世以来，几经技术更迭，如今在感染性疾病、肿瘤、遗传病等医疗领域获得了广泛应用。第一代PCR技术在扩增后，通过凝胶电泳进行分析，仅可获得定性结果。直到20世纪90年代，伴随着生物荧光技术的发展，实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)应运而生，并成为核酸定量检测的主流技术，沿用至今。由于qPCR为大体积反应系统，存在较多的背景干扰，无法获得绝对定量结果，随着检测要求的提高，qPCR逐渐无法满足临床一些超高灵敏度、精密度的检测要求。至20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，将一个样本分充分稀释，分配到不同的反应单元，每个单元包含少于或等于一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中进行单独、平行的PCR反应分，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，以实现绝对定量及稀有等位基因的检测。 数字PCR技术原理 dPCR反应系统一般包含两部分，即PCR扩增和荧光定量。
与qPCR反应系统不同，dPCR在扩增前需进行样本稀释，构建多个独立反应单元，每个单元内包含一个或不含目标扩增核酸。这一步预处理目前主要实现方式包括：基于液滴微流控的微滴数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)和基于芯片式微流控的微阵列芯片式PCR。目前在数字PCR市场处于领先地位的伯乐（Bio-Rad）公司采用的技术为微滴数字PCR。完成样品的反应单元构建后，部分反应单元包含了靶标分子（阳性），而其他不包含（阴性）。单个分子可以被扩增一百万倍或更多。在扩增期间，TaqMan化学试剂及染料标记探针可用于检测特定序列的靶标。当不存在任何靶标序列时，没有信号累积。PCR分析后，阴性反应片段用于生成样品中靶标分子的绝对计数，而无需标准品或内标。 荧光定量分析时，不同于 qPCR对每个大体积反应系统循环进行实时荧光测定，dPCR 技术在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。 在临床实际应用中，常需对多个指标同时进行测定，以提高效率，降低成本。由于dPCR技术单个反应腔仅包含一个或无目标核酸，无法通过qPCR的多腔室扩增与多荧光通道结合方式实现多目标同时检测。目前dPCR多指标检测可通过添加多种荧光染料，进行不同目标物标记，多荧光通道检测，或采取单一荧光染料不同荧光强度的方式实现。 数字PCR市场简析 2010年国内分子诊断市场规模仅为10亿元左右，随着技术的不断进步，分子诊断市场快速增长，占整个体外诊断市场20%左右。随着临床应用的不断开拓，行业增速有望在较长时间内维持20%以上。
PCR技术作为分子诊断的重要组成部分，占分子诊断领域近40%份额，据预测，我国PCR市场在2021年将达53.4亿元，符合增速超13%。 目前数字PCR市场规模并不大，全球约1.5亿至2.5亿美元，占到实时定量荧光PCR市场总规模(约20亿美元)的10%，但增长趋势显著，有望在技术成熟后与目前的荧光定量PCR平分江山，甚至逐步替代现有的二代PCR技术。 数字PCR竞争格局简析 国际巨头纷纷布局 1.伯乐（Bio-Rad） 无论是技术水平，还是市场份额，拥有二十多年PCR产品研发、生产经验的伯乐公司伯乐都是当前数字PCR市场领跑者。伯乐于2011年斥资1.62亿美元，完成QuantaLife公司的收购，正式进军数字PCR市场，随后推出QX100、QX200微滴式数字PCR系统以及最新的QX One集成液滴数字系统。同时伯乐于2017年收购液滴式数字PCR系统制造商RainDance Technologies，该公司核心技术可在短时间内生成数百万个皮升级的微液滴，可将伯乐原液滴数提升250-500倍。两者的融合进一步稳固了伯乐在数字PCR领域的领军地位。据最新财报显示，伯乐2019年实现销售收入超23亿美元，ddPCR增长强劲。
2.赛默飞（Thermo Fisher） 赛默飞于2013年斥资136亿美元，同时继承22亿美元债务，完成对Life Technologies的收购，随即推出QuantStudio™ 3D数字PCR系统。与伯乐的微滴式数字PCR不同，赛默飞的产品采用的是硅基材料纳升微孔板芯片技术，将样本均匀的分配至20000个单独的反应孔中。
3.Stilla Technologies Stilla Technologies作为一家成立于2013年的年轻法国公司，在2018年获得测序大亨Illumina 1600万欧的A轮投资。2016年，Stilla Technologies推出Naica crystal微滴数字PCR系统，旨在为专门从事分子生物学的研究机构精确定量DNA突变。2019年发布高通量数字PCR系统-Naica HT，配合新型的Opal芯片，较Naica数字PCR系统的通量有效提高四倍。同时，Stilla公司正在开发六色检测的数字PCR系统，进行多重目标基因的数字PCR检测，目前该系统正在测试中，预计将于2020年或2021年上市。
4.凯杰 作为一家全球领先样品制备和分析技术，凯杰通过收购Formulatrix公司数字PCR技术，正式跨界数字PCR市场。凯杰计划将自己样本分析的先进技术及自动化解决方案与数字PCR技术相结合，完成新一代数字PCR系统的开发，并开始手持电池驱动的数字PCR系统研发。凯杰曾预测其产品将于2020年面世。 5.罗氏 罗氏在研的数字PCR系统，将有望实现良好的多靶点混合检测，或将代表数字PCR革新向前推进了一大步。罗氏计划通过欧盟 CE/IVD 的认证，在临床进行商业化推广，并计划在美国获得上市前申请（510k）豁免认证，以进行销售。罗氏本次研发的新数字PCR仪面世或将成为Bio-Rad的液滴数字PCR仪的劲敌。 国内新锐频现 1.领航基因 领航基因致力于数字PCR产业链中游产品的研发、生产和销售，产品覆盖数字PCR技术相关的设备、芯片和体外诊断试剂等。 领航基因研发的iScanner24生物芯片阅读仪于2018年获得浙江省食品药品监督管理局医疗器械产品注册证，其新一代产品生物芯片阅读仪iScanner 5也于2019年获得浙江省药品监督管理局正式批准上市，iScanner 5实现了五色荧光通道同时采集信号，处于全球技术领先地位。同时样本制备仪也已取得医疗器械一类备案证。 领航基因将提供数字PCR综合结局方案，未来将向市场推出全自动数字PCR仪，以及肿瘤伴随诊断相关试剂盒和染色体拷贝数异常检测试剂盒等。
2.新羿生物 新羿生物（TargetingOne）成立于2015年，在数字PCR领域拥有从芯片、仪器、软件到原料、试剂、耗材全系统研发能力。目前公司主要的产品包括： ①Drop Maker 样本制备仪：采用光、机、电一体化设计，配套具有自主知识产权的微流控芯片，可以将水相样本快速制备成纳升体积的液滴。液滴数与样本体积相关，30微升样本可制备约5万个液滴。液滴尺寸均一，并可在PCR扩增后保持稳定。 ②Chip Reader 生物芯片分析仪采用光、机、电一体化设计，及激光共聚焦原理，配套有自主知识产权的微流控芯片，可以准确快速地定位、识别纳升体积微液滴，获取其荧光信号值。经过泊松统计分析，提供研究者所需的阳性、阴性液滴数绝对数值，从而推算出起始靶标核酸分子的精确浓度。Chip Reader 生物芯片分析仪兼容Taqman水解探针和EVAGreen检测。
3.锐迅生物 苏州锐讯生物结合微流控、光学、精密仪器、电子工程学和生物化学技术，自主研发分子诊断与基因检测领域的上游设备和耗材。自主研发的DropX-2000数字PCR系统能实现高度自动化单分子绝对定量，核酸分子单分子绝对定量灵敏度达到0.001%或更高。同时产品采取专利平板扩增技术，配合极速升降温模块，最快2.5小时完成检测。四荧光通道设计，支持FAM HEX/VIC ROX CY5，支持探针法与染料法。样本通量2-96样本/批，并可定制。
4.科维思生物 南京科维思生物科技股份有限公司创立于2012年，一家专注于肿瘤基因检测的仪器及试剂研发、生产企业。其生物阅片仪（含芯片）已获得江苏省食品药品监督管理局医疗器械产品注册证。同时基于数字PCR的平台，已研发出HER2, PIK3CA, ESRI, EGFR, MET, ALK, KRAS, HRAS, BRAF, TP53 10个基因共计59个不同突变的检测产品。
5.达普生物 达普生物(ThunderBio Innovation Limited)成立于 2018 年，由多位海归博士、企业家、管理团队以及香港科技大学，英国帝国理工等技术团队共同创立。其产品液滴产生仪，可同时处理32个样本，液滴芯片生成仅需两分钟，可实现一键自动化操作。另一重要产品生物芯片阅读仪，为开放试剂平台，FAM\CY5双通道荧光检测，4万液滴，检测仅需20秒。
6.其它 除上述企业外，国内数字PCR的玩家还包括泛生子、诺禾致源、小海龟、卡尤迪、永诺生物等。
总结 数字PCR技术作为新一代PCR技术，市场前景广阔，应用领域众多，临床需求明确，由此受到国际巨头和国内新锐公司的青睐。目前整个数字PCR市场已进入成长期，资本关注度越来越高。但同质化以及是否具有核心技术仍需资本重点关注。 信息来源：智银医药，作者智银 |
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