诊断技术 | 免疫测试的那些事——抗体和免疫测试的介绍

本文的目的是对免疫测试进行详细和实用的介绍，并为后续关于其他免疫测试的具体关键要素的讲解奠定总体背景。

在整个文章中，我计划概述抗体的产生、各种抗体结构及其在免疫测试中的基本作用。并且提供了从直接法到竞争法的不同免疫测试形式的全面指南，随后，研究了重要的信号系统，包括酶联免疫法和荧光法。最后，描述了用于下一代免疫测试的电、机械和光学信号传导机制。

免疫测试是利用免疫球蛋白（Ig）（抗体）作为高灵敏度的粘合剂来检测低浓度分子的存在的生化试验。抗体是体液免疫系统的一个组成部分，是自然界的主要识别装置。它们存在于B细胞（B-淋巴细胞）的表面，识别外来抗原的存在。

B细胞可以检测并发出信号，表明存在广泛的抗原，包括从朊病毒到病毒、药物、毒素和入侵我们身体的异常生物大分子的分子。免疫球蛋白以许多不同的形式存在，免疫球蛋白的五个主要同型是IgG（如图1所示）、IgM、IgD、IgA和IgE。

图1 免疫球蛋白G（IgG）的结构。IgG由两条重链（由恒定结构域CH1、CH2和CH3以及可变重结构域VH组成）和两条轻链（由恒定轻结构域CL和可变轻结构域VL组成）组成，通过二硫键连接。抗原结合区由一条可变重链和一条可变轻链组成，它能识别抗原的表位（发生结合的特定区域）。

由于抗体具有天然的高亲和力和出色的半衰期，它们始终处于靶向治疗和诊断的最前沿。可以很容易地用标准的分子生物学技术操作成定制的抗体，并且在选择的终端应用中有效地执行。

生物制药行业已经在基于抗体的诊断和治疗方面进行了大量的投资，而抗体类大分子药物目前代表了最大和增长最快的生物制药类别。

抗体通常以三种形式出现：

• 多克隆（由各种B细胞克隆的混合物产生）；

• 单克隆（由单一的B细胞克隆分泌）；

• 重组抗体（对抗体基因进行遗传处理的产物）。

多克隆抗体的生产包括用抗原和佐剂（刺激免疫系统的物质）的混合物对动物进行免疫，导至多个针对不同抗原表位的B细胞被激活。这产生了大量的具有不同特异性和表位亲和力的抗体。

这些多克隆抗体是从免疫动物的血清中纯化出来的。多克隆抗血清可以相对快速地获得（对于高免疫原性的抗原，6~12周），但时间可能取决于抗原。纯化的方法通常与抗体的类型和抗体的预期应用有关，这些方法在表1中列出。

生产多克隆抗体需要考虑几个关键步骤，包括：

1) 抗原的制备/可用性；

2) 宿主物种的选择；

3) 注射方式；

4) 监测抗体对免疫原的反应；

5) 抗体的收集/纯化。

在开发针对人类目标的多克隆抗体时，宿主的选择特别重要，因为大量的蛋白质在整个哺乳动物进化过程中是高度保守的，因此，在许多哺乳动物物种中是共同的。

因此，将这些蛋白质免疫到兔子和小鼠身上，可能会产生有限的免疫反应。使用在系统发育上与人类相距较远的物种，如鸡（大约3.1亿年前从哺乳动物的基因组中分化出来），是对高度保守的人类蛋白进行免疫和选择抗体的理想选择。

“杂交瘤技术”的发展为Georges K¨ ohler和C′esar Milstein赢得了1984年的诺贝尔生理学或医学奖。他们创造了一种不死的细胞系，能够产生无穷无尽的具有已知特异性的相同的抗体，称为“单克隆抗体”，标志着它们来自一个单一的混合细胞，单克隆抗体的生产如图2所示。

图2 通过杂交瘤技术生产单克隆抗体。来自免疫小鼠的B细胞被分离出来，并与骨髓瘤细胞系融合，形成杂交瘤（通常通过添加聚乙二醇（PEG）的方式）。特定杂交瘤的克隆和选择是通过“限制性稀释”进行的。克隆被筛选出反应性，产生特定抗体的克隆被进一步定性和扩增以产生所需的抗体。

重组抗体对于定制化的抗体开发是非常有吸引力的，因为可以很容易地采用遗传操作来精确定制其特异性和生物物理特性。

在大肠杆菌中容易产生大量的重组蛋白，而且生产成本很低，这促进了各种不同的抗体构建体的出现，这些构建体可以被用于各种各样的应用中。一些常见的重组抗体构建体显示在图3中。

图3 抗体片段的构建。哺乳动物IgG构建体（150 kDa）由两条重肽链和两条轻肽链组成，通过二硫键连接在一起。重链由可变重区（VH）和三个恒定区（CH1，CH2，和CH3）组成。scFv由VH和VL链通过一个柔性连接体连接在一起组成。单链抗体（scAb）片段由一个scFv和一个额外的恒定链（重链或轻链）组成。Fab（抗原结合片段）包含完整的轻链与VH和CH1。F(ab')2是由两个Fab片段组成，通过二硫键结合在一起。

保留人类IgG全部单价抗原结合能力的最小的抗体片段是可变片段（Fv），它由可变重域（VH）和可变轻域（VL）组成，通过非共价作用结合在一起。

单链可变片段（scFv）比Fv更稳定（Fv比scFv更容易聚集），通常，一个灵活的15个残基的甘氨酸/丝氨酸（（Gly4Ser）3）链接器被加入，将链连接在一起，帮助抗体折叠和在细菌表达中的稳定性。

抗原结合片段（Fab）是一个更大、更稳定的片段，大约为50kDa。Fab片段由可变重链、可变轻链、恒定重链和恒定轻链（VH和CH1以及VL和CL）组成。在CH1和CL之间存在一个链间二硫键（图3）。

可以设计的不同类型的重组抗体结构有各种优势和劣势。还应该注意的是，抗体片段可以相对容易地被重新格式化，以改善其特性，如表达，减少非特异性结合和增强特异性。超级抗原特异性重组片段的选择可以通过称为噬菌体展示技术的过程来实现。

当George P. Smith在1985年首次证明在丝状噬菌体中可以建立表型和基因型之间的联系时，噬菌体显示技术出现了。

在过去的几十年里，对抗体结构和功能的进一步了解使得噬菌体展示成为控制选择独特抗体的最有力的工具之一，这些抗体具有传统杂交瘤方法无法达到的特性。

噬菌体展示法可用于原始、免疫或合成，并允许从高度多样化的抗体片段组合库中对确定的抗原构象进行控制性选择和筛选抗体。筛选包括让噬菌体库连续接触抗原，让抗原特异性的噬菌体显示的抗体与它们的目标结合，这个过程被称为“淘金”。

抗原特异性的噬菌体被回收，随后被感染到细菌中进行再扩增。理想情况下，高亲和力的抗体会在第一轮中被选中。然而，噬菌体的非特异性结合限制了每一轮中可以实现的富集。

因此，有必要进行2~5轮的选择，以确定高亲和力的结合物。图4中概述了一轮选择的过程。

图4 通过噬菌体展示选择抗体。“淘洗”的过程是通过噬菌体库与目标结合，清洗以去除未结合的噬菌体和洗脱目标特定的噬菌体来选择确定的克隆。这个过程要重复若干“轮”，以富集高亲和力的结合物。