下一代分子诊断技术的觉醒

自动化的高通量测序系统已经对生命科学研究产生了不可磨灭的影响。它们现在正准备革新分子诊断技术。

CRISPR和下一代测序技术正在革新从传染病到早期癌症检测的分子诊断，这门科学可能引领什么？

CRISPR基因编辑和下一代测序（next-generation sequencing, NGS）技术已经革新了临床和生命科学研究模式。CRISPR允许对特定的核苷酸序列进行有选择的靶向和编辑，其精确度和易操作程度在几年前是无法实现的。NGS可以实现高通量、精确且可负担的DNA或RNA测序。

这些技术共同促进了基础分子和细胞生物学以及疾病研究的众多进展，CRISPR的发现甚至为其背后的研究人员赢得了2020年的诺贝尔奖。它们也在帮助开发新的基因和癌症疗法，如CAR-T细胞。

虽然这些成就被广泛认可，但CRISPR和NGS对分子诊断的影响也可能同样深远。一些基于CRISPR和NGS的诊断方法已经进入临床，但正在开发的应用数量要多得多。这些诊断方法可以实现早期疾病检测、准确的疾病监测以及在众多领域的精准治疗中更灵活的管理。

正如早期的免疫吸附测定或荧光原位杂交一样，CRISPR和NGS为开发分子诊断的人提供了重要的机会。这门科学处于什么位置，它可能引领什么？

CRISPR作为一种诊断手段

2016年，美洲的寨卡（Zika）病毒爆发为第一个获批的CRISPR诊断创造了条件。此后，CRISPR诊断法被用于检测拉萨（Lassa）和埃博拉（Ebola）病毒，以及SARS-CoV-2。迄今为止，传染病的爆发推动了技术的发展。但任何需要对已知基因靶点有高选择性的环境，如肿瘤样本的分析、遗传性基因变体的鉴定或无创产前检测（non-invasive prenatal testing, NIPT），都可能是CRISPR诊断的候选对象。

CRISPR是最著名的基因编辑系统，其中Cas9蛋白经过设计与向导RNA配对，然后与靶DNA互补结合。当靶DNA被识别后，Cas9会在一个确定的位置剪切序列，允许基因删除或插入。

基于CRISPR的诊断背后的机制与基因编辑相似，因为它使用了一种经过设计的向导RNA。但它通常采用不同的Cas蛋白，即Cas 12、Cas 13和Cas 14。这些蛋白质可以被修饰，以便在靶核苷酸序列（DNA或RNA）存在的情况下产生荧光信号，使该系统适用于检测或成像。

虽然大多数研究人员都在开发他们自己的CRISPR诊断方法，但最近出现了两个商业平台来加速这一过程。SHERLOCK是由博得研究所（Broad Institute）的Feng Zhang小组开发的。而DETECTR则是由Jennifer Doudna与她在加州大学（University of California）伯克利分校的团队一起创建的（Doudna因发现CRISPR-Cas9而获得诺贝尔奖）。这两个平台都使用CRISPR提供快速体外鉴定靶序列的atto摩尔级别的灵敏度。

与任何分子诊断相同，CRISPR测试需要足够的靶DNA用于检测。因此，它们通常在检测之前依赖一个扩增步骤。这通常是通过聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）来完成的，聚合酶链反应是一种需要热循环仪扩增核苷酸序列的高保真方法。与真正的基于PCR的诊断方法不同，例如逆转录酶PCR（reverse transcriptase PCR, RT-PCR），CRISPR诊断也可以使用其它扩增方法，这是一个优势。

赛默飞世尔科技公司（Thermo Fisher Scientific）的基因组编辑产品经理Matthew Poling表示，当开始考虑在临床医生的办公室或现场进行此操作时，他们没有热循环仪。为了使对于这些诊断方法进入以患者为中心的即时护理工作，LAMP正变得更有前景。

LAMP或称环介导的等温扩增（loop-mediated isothermal amplification）是一种新兴技术，可在恒定温度下扩增核苷酸序列。与PCR中用热分离双链DNA不同，LAMP需要一种DNA聚合酶（DNA polymerase），如EquiPhi29或BSM DNA聚合酶，来主动“解旋”和扩增双链DNA。该技术也可用于检测RNA序列。

除了CRISPR试剂，赛默飞世尔科技公司还提供各种LAMP聚合酶作为冻干兼容的酶。这些可冻干的酶不含甘油，在运输和储存时保持稳定，使它们更适合在现场或在医疗点使用。

使用CRISPR技术诊断癌症

肿瘤学是最大的一个可能受益于CRISPR诊断的临床领域。虽然现在还不可能走进医生的办公室并要求进行CRISPR测试，但研究人员正在进行这项工作。在一个原理验证的实验室中，科学家们使用SHERLOCK平台来检测已知的癌症突变。其他研究者正在采取不同的方法。

Harveer Dev是英国癌症研究中心剑桥中心（Cancer Research UK Cambridge Centre）早期检测项目（Early Detection Programme）的临床讲师和组长，目前正致力于分析和识别前列腺癌的普遍生物标志物。他正在开发一个名为ProCASP的基于CRISPR的平台，该平台可以绘制个体肿瘤的遗传变异，以帮助预测其对某些药物的敏感性。

Dev表示，其目的是绘制个体患者的肿瘤内特定基因的功能图谱。他希望他的工作最终能转化为一种诊断，为病人的治疗计划提供参考。

如果还有另外一层信息可以补充，Dev认为这对于打造不同患者所接受的特定治疗将非常重要。

在癌症和其它疾病中，CRISPR诊断仍然面临挑战。例如，当前的CRISPR诊断还不能在高通量环境中使用。此外，所有基于CRISPR的诊断平台都需要一个单一的已知靶序列，这在某些癌症和其它多因素遗传性疾病中可能尤其具有挑战性。在CRISPR工具能够同时应用于多个基因之前，需要这种复用类型的诊断可能更适合下一代测序工具。

诊断学中的下一代测序技术

与CRISPR相同，下一代测序技术已经从一个标准的研究应用迅速推进到一个复杂的诊断工具。

立陶宛维尔纽斯赛默飞世尔科技公司的研发经理Žana Kapustina表示，当NGS变得可负担时，它实现了无假设实验，研究者并不需要知道他们在寻找什么。

如今，快速平行测序使研究人员能够寻找未知的基因变异，如检测罕见的疾病，或一次性筛选出一组可能的基因变异。该方法已成为肿瘤学的基础，即开发液体活检或精准疗法的辅助诊断，并且它正在研究应用于遗传性听力和视力损失、遗传性心肌病和常染色体显性多囊肾等疾病的诊断。NGS还能实现单细胞测序，这使得可以在单个细胞水平上发现生物标志物。

在这一点上，NGS技术已经很成熟了，但研究人员仍然面临着一些持续的挑战。其中之一是文库制备。在任何NGS筛选中，研究人员首先将样本DNA分割成小片段，并对其进行标记以方便识别。然后对这些片段进行测序，并对结果进行分析。这可能是一个耗时的过程。

Kapustina表示，不幸的是，他们不能跳过文库的准备工作，但他们正在努力使这些工作流程尽可能地简洁和方便。赛默飞世尔提供了一系列标准化试剂，支持Ion Torrent和Illumina测序仪的文库制备，同时还为开发特定诊断的研究者提供专家指导服务。

研究人员的另一个挑战是样品的稳定性。赛默飞在维尔纽斯的产品经理Sigita Činčiūtė表示，这对使用液体处理机或机器人系统的人来说非常重要，因为他们[加入他们的样品并]将其放置一段时间，甚至几天。赛默飞积极与研究人员协商，帮助他们建立考虑到这些因素的工作流程和诊断方法。

扩展诊断工具箱

适用于分子诊断的技术并不是很常见。分子诊断市场仍由数十年的PCR和ELISA检测所主导。CRISPR和NGS诊断程序的发展为扩展这一组合提供了难得的机会。

事实证明，这两种技术都很容易适应和扩展，允许快速开发和测试候选诊断，而且它们都相对成本低，使它们对保险公司和卫生系统更容易接受。它们还能相互补充，NGS可用于识别未知变异或同时筛查几个已知的生物标志物，而单细胞测序CRISPR诊断很适合在现场或医疗点使用。

CRISPR和NGS诊断不太可能取代更成熟的方法。相反，几乎可以肯定的是，它们将扩大目前无法获得的不同类型的诊断信息。就Dev而言，他已经在使用多种工具来诊断前列腺癌。

Dev表示，无论最终依靠什么诊断工具，它都将是多模式的，这些工具不可能孤立地存在。

这对那些追求分子诊断的人来说是个好消息，或者对CRISPR和NGS在农业或生物燃料领域更远的应用发展来说是个好消息。但最重要的是，这对患者来说是个好消息。

原文检索：
(2021) An awakening in next-generation molecular diagnostics, nature research custom media.