定性检测试剂丨阳性判断值确定方法初探（二）

在上一篇中小编解读了[往期链接➡️《定性检测试剂性能评估注册技术审查指导原则（征求意见稿）》（2019年9月25日）]中有关阳性判断值的内容。

此篇中解读一下《胎儿染色体非整倍体（T21、T18、T13）检测试剂盒（高通量测序法）注册技术审查指导原则》(2017年04月01日 发布)中有关阳性判断值的内容：首先，摘抄一下此指导原则中的相关内容；其次，补充说明一下具体实施的方法。

由于目前胎儿染色体非整倍体T13、T18、T21的阳性判断值存在多种计算方式，且更好的算法和数据处理方式仍在不断开发中。因此，如申请人选择了某一算法作为阳性判断值的计算方式，则应详细阐述选择该算法作为阳性判断值依据的原因（如权威文献、行业共识等），并详细阐述计算公式和各参数代表的意义。

以大样本量常用的Z-值（Z-score）算法来举例说明：

1.Z-值这个统计量反应的是当前数值距离平均数的相对标准距离，Z-值的应用条件为大样本量以及数据符合正态分布，计算公式如下：

1.1chrN z-score for test sample:所检测样本的Z-值；

1.2 N：指定的第N染色体；

1.3%chrNsample：待测样品第N条染色体唯一比对序列数占常染色体的百分比，通过高通量测序后软件分析获得；

1.4 Mean%chrNreference：参照样品第N条染色体比例平均值；

1.5S.D.%chrNreference：参照样品第N 条染色体比例的标准偏差。

该公式中，影响唯一比对序列的因素包括GC含量、检验覆盖度等，申请人应计算并统计检验覆盖度是否在正常范围内。参照样品的数量、来源等均对其数据产生影响，进而影响Mean%chrNreference和S.D.%chrNreference。因此，申请人需对参照样品的数据计算进行详述，并提供计算值。

2.被筛查孕妇所怀胎儿的染色体数量状况符合正态分布，即大概率为正常染色体数量，小概率事件为胎儿染色体非整倍体，如图1所示：

 图1 正态分布图

如图1可以看出，出现在Z-值为正负3以外的数值，则有99.9%的可能为阳性，因此，通常将Z-值=3定为阳性判断值分界点，Z-值>3或Z-值<-3判断为胎儿染色体非整倍体阳性。 申请人应当根据试验对Z-值>3及Z-值<-3的情况分别进行说明。

鉴于并无100%阴阳性分界点，一般来说，申请人应设定阳性判断值灰区范围，灰区的设定应提交理论和实际试验结果的依据，并在说明书【阳性判断值】和【检验结果的解释】项进行解释说明，如：是否需要用产前诊断的方式进行最终确认，可能的原因，是否需要孕龄再大时进行再次抽血复测等等。如无灰区设置，也应提交理论和大样本量试验结果的依据。

在阳性判断值设定后，申请人应当选取一定数量阴、阳性真实临床样本进行试验验证，如与该公式不符，则应说明出现的问题及详细的数据校正方式。

上述阳性判断值的确定方法的描述和医学参考值的确定方法颇有相似。针对体外诊断试剂的阳性判断值（之前叫过参考值、参考范围等）的定义可见《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——参考值（参考区间）》。但，此文件中对它的定义和要求有些抽象，因此本篇中以借助医学参考值的确定方法来解读一下此篇中要探讨的阳性判断值。

医学参考值（medical reference value），是指包括绝大多数“正常”人的人体形态、功能和代谢产物等各种生理及生化指标的常数，也称正常值。而“正常”人的生物医学数据随着环境、时间等条件在一定范围内波动，这个正常范围的波动即为医学参考值范围（medical reference range）。通常情况下，医学参考值范围的基本界定方法有正态分布法和百分位法。

对服从正态分布的医学数据，可采用正态分布法计算参考值范围；呈偏态分布的资料，若能通过变量转换为正态分布，也可用正态分布法制定参考值范围。采用此方法前一般要对资料进行正态性检验，且要求样本含量足够大（如n≥100）。其计算公式为

公式中为均数，S为标准差，μ值可由下表查出：

在NIPT指导原则中所使用的是此方法，不过要注意的是，数据一定要先做正态检验，数据符合正态分布才可以使用正态分布方法确定参考值。NIPT指导原则中的需要对确定阴性的样本的z-值（T13阴性样本的z-值、T18阴性样本的z-值、T21样本的z-值）进行正态检验并计算其参考值。使用spss软件进行正态性检验和正态分布方法确定参考值的具体步骤，大家可观看视频（https://www.bilibili.com/video/av25160765）自行学习。

那如果数据经正态检验后发现不符合正态分布时，又怎样确定其参考值范围呢？此时，可用百分位法确定。此方法要求的样本含量比正态分布法要多（不低于100），其计算公式为：

NIPT中可以分为2步，第一步可先计算Z值，之后使用百分位方法计算参考值范围，关于百分位方法计算参考值的具体步骤，大家可以观看视频（https://www.bilibili.com/video/BV1ss411j7b6?from=search&seid=16036317285303194830）自行学习。