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老师都没教过的PCR实验室辅料质检

2020-11-30 00:00| 编辑: 归去来兮| 查看: 1674| 评论: 0|来源: 原博士带你做检测 | 作者:原博士

摘要: 昨晚我和我的两个助理一起讨论完这个主题后,一个助理得知闺蜜生病,心急如焚又帮不上忙。我在这里祝愿助理的闺蜜早日康复!在之前的文章中(#检测全流程的质量控制)已经探讨了扩增试剂、PCR仪、提取试剂乃至采样拭 ...

    昨晚我和我的两个助理一起讨论完这个主题后,一个助理得知闺蜜生病,心急如焚又帮不上忙。我在这里祝愿助理的闺蜜早日康复!

    在之前的文章中(#检测全流程的质量控制)已经探讨了扩增试剂、PCR仪、提取试剂乃至采样拭子的评价方式。今天我们继续探讨PCR实验室最容易忽视的环节,对试验辅料进行质检。PCR实验室的辅料指的是PCR实验中常用的一些辅助试剂和耗材,比如采样管、拭子、离心管、PCR管、吸头、移液器、无核酸酶水和试管架等。



一.辅料质检的基本原则

辅料的质检通常是在新一批的辅料到实验室后统一做一次或者定期(半年或1年)做,因此质检就包含了验货和质检2个部分。由于辅料的质检没有一个统一的标准,一般由各实验室自行制定,可简可繁,这里提出一些方法供大家参考和批评指正。

1.外包装检查:外包装应完整无损无污,标识清楚,检查品名、品牌,货号,规格、生产日期,有效期、保存条件等信息。

2.内包装检查:内包装物品应与外包装标识一致,检查是否有破损,泄漏,内容物是否齐全,是否有相应的使用说明书等

3.性能质检:检测试剂耗材是否与其性能一致,比如吸头的准确性和气密性等

4.污染物质检:检测试剂耗材是否被常规检测项目的待检物污染,这种污染可能是物品生产环节,也可能是运输或实验室的保存过程中被污染。

5.抑制物质检:检测试剂耗材中是否存在PCR反应的抑制物,比如核酸酶。



二.辅料质检的前提条件

1.弱阳性质控:需要准备弱阳性质控,包括标准物质、第三方质控或弱阳性样品用于进行性能质控和抑制物质控。

2.阴性质控:需要准备确定阴性的样品或空白对照,用于进行污染物的质控。

3.重复次数n:中国人喜欢3(三顾茅庐),6(六六大顺),8(發發發),9(九九归一),很遗憾这些数和实验室都关系不太大。符合统计学计算的最常用的两个数字是5和20,5通常是能进行统计学分析的最少重复次数,20通常用于计算95%的置信区间。大家根据自己的需要选择合适的重复次数。



三.常见辅料的质检

辅料的质检应结合实际工作中可能用到的场景,并非越苛刻越好,需要每个实验室结合自身情况来设计和调整文中提到的参数。

1.离心管:

(1)渗漏密闭性:将n个离心管加入半量墨汁,盖好盖子后放入水中,浸泡30min,没有墨汁渗出为合格。

(2)离心密闭性:将n个离心管加入半量纯水,放入离心机,10000 rpm,30min,管盖未崩开未漏液为合格。

(3)热密闭性:将n个离心管加入半量纯水,盖好盖子称重后放入金属浴中,65℃或90℃(巴氏消毒),30min,再进行称重,离心管未变形,管盖未崩开未漏液,前后重量未变化为合格。。

(4)冷密闭性:将n个离心管加入半量纯水,放入-20℃冰箱,24h,离心管未变形,管盖未崩开未漏液为合格。

(5)污染物质检:将n个离心管分别加入半量阴性纯水,盖好盖子涡旋1 min后静置5min,吸取纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(6)抑制物质检:将n个离心管分别加入弱阳性质控物,室温静置5min,然后进行提取;RNA核酸,DNA核酸,室温静置5min,作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。

2.PCR管:

(1)渗漏密闭性:将n个PCR管加入半量墨汁,盖好盖子后放入水中,浸泡30min,没有墨汁渗出为合格。

(2)离心密闭性:将n个PCR管加入半量纯水,放入离心机,1000 rpm,30min,管盖未崩开未漏液为合格。

(3)热密闭性:将n个PCR管加入半量纯水,盖好盖子称重后放入PCR仪,设置一个常用的PCR程序,程序运行完毕后,再进行称重,PCR管未变形,管盖未崩开未漏液,前后重量未变化为合格。。

(4)冷密闭性:将n个PCR管加入半量纯水,放入-20℃冰箱,24h,离心管未变形,管盖未崩开未漏液为合格。

(5)污染物质检:将n个PCR管加入半量阴性纯水,盖好盖子涡旋1 min后静置5min,作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(6)抑制物质检:将n个PCR管分别加入弱阳性质控物,室温静置5min,然后进行提取;RNA核酸,DNA核酸,室温静置5min,作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。

(7)空白荧光通透性:对于qPCR,需要考察PCR管是否有非特异性荧光信号,将n个空PCR管,盖好盖子后放入PCR仪,设置一个常用的PCR程序,程序运行完毕后,qPCR无扩增为合格。

(8)阳性荧光通透性:对于qPCR,还需要考察PCR管是否会抑制荧光的通透性,将n个含弱阳性样品和扩增试剂的PCR管,与确认无荧光干扰的PCR管,盖好盖子后放入PCR仪一同扩增,设置一个常用的PCR程序,程序运行完毕后,qPCR扩增未被抑制为合格。


3.滤芯吸头:测试吸头需使用经校准的移液器

(1)准确性:将n个吸头分别吸取定量的纯水称重,重量与体积的关系按照1 g/mL换算。

(2)气密性:取n个吸头,吸取最大量程的含有1%甘油的墨水,观察有色液体不出现在滤塞之上,液面相同为合格。

(3)防气溶胶性能:取n个吸头,吸取阳性核酸,反复吹吸10次,换另一个新吸头在阴性纯水中反复吹吸10次,取阴性纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(4)污染物质检:取n个吸头,吸取阴性纯水反复吹吸10次,取阴性纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(5)抑制物质检:取n个吸头,吸取弱阳性质控物反复吹吸10次,然后进行提取;吸取RNA核酸和DNA核酸反复吹吸10次,作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。

4.采血管、采样管、采样拭子和一次性吸管等:主要考察污染物和抑制物

(1)污染物质检:将n个耗材加入一定量阴性纯水,盖好盖子涡旋1 min后静置30min,吸取纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(2)抑制物质检:将n个耗材分别加入弱阳性质控物,室温静置30min,然后吸取质控物进行提取;作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。

5.无核酸酶水、PBS等缓冲液:

(1)PH值:测量各缓冲液的PH值。

(2)污染物质检:吸取缓冲液作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(3)抑制物质检:将缓冲液分别与RNA核酸和DNA核酸混合,然后吸取混合液作为模板进行扩增,qPCR扩增未被抑制为合格。

6.移液器和离心管架及离心机的内外表面:这些常见物品的外表面容易被核酸和细菌污染,主要查看这两个指标。

(1)表面核酸污染:用沾湿的拭子擦拭上述物品的外表面,然后浸泡到纯水中10min,吸取纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(2)移液器内腔核酸污染:对于常用的移液器的内部,可使用无滤芯的吸头在阴性纯水中吹吸10次后,吸取纯水作为模板进行扩增,qPCR无扩增为合格。

(3)表明细菌污染:用沾湿的无菌拭子擦拭上述物品的外表面,划琼脂平板,每个平板的菌落数不应超过一定数量(我也不确定多少合适,由于不要求无菌操作一定会有细菌,但是也不应该太多)。

    非瘟和新冠后全国一下子新增了很多核酸检测实验室,早期大家关注的点都在设施和硬件上,但是一个检测实验室开展大量检测工作之后,检测中最弱的环节决定检测的质量。我们也需要将精力放在检测中的每个细节上。

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