关于PCR技术那些事

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是一种分子生物学技术，用于体外扩增特定的DNA片段。

PCR之父 Kary Mullis

基本原理：

反应过程：

• 变性——将被复制的DNA片段在高于其Tm的条件下（94~95℃）加热，使DNA双螺旋结构的氢键断裂二解螺旋，形成两条单链分子作为扩增反应的模板，以便与引物结合。

• 退火——将反应体系的温度降至寡核苷酸（引物）的熔点温度以下（40~70℃），以便使引物能与模板DNA序列互补结合，形成杂交链。

• 延伸——将反应体系的温度升至72℃左右，此时反应体系按照模板链的序列以碱基互补配对原则以此把dNTP加至引物的3’端，在Taq DNA聚合酶的存在下，杂交链不断延伸，直至形成新的DNA双链。

● 逆转录PCR

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

● 巢式PCR

对靶基因进行二次扩增，第二次扩增所用的模板为第一次扩增的产物。

● 多重PCR

在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样品中同一靶基因多个不同序列的片段或多个不同靶基因的片段。

● 单细胞PCR

单细胞PCR技术建立于1991年，研究者用膜片钳技术成功地从单个细胞中获取了细胞质，并以此为材料进行了RT-PCR用于神经例子通道的研究。

● PCR诱导定点突变

在PCR产物一端引入点突变，只需一对引物进行一次PCR扩增：用一条带有限制性酶切位点（位点A）和预期突变的诱变引物（P1）和一条带有另一个限制性酶切位点（位点B）的野生序列引物进行PCR扩增，由此获得的扩增产物的P1端便带有突变点。

● 原位PCR

直接法：使用标记（放射性同位素、生物素、地高辛、荧光素等）的引物或脱氧三磷酸核苷酸（如dUTP）进行PCR扩增，则标记物掺入到PCR产物中。最后用放射自显影、免疫组化或荧光法检测 PCR产物及其在细胞内位置。

间接法：先进行细胞内DNA的原位扩增，然后用标记的核酸探针进行原位杂交。

● 荧光定量PCR

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术，在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。

● 数字PCR

通过将一个反应体系分成几千到数万个反应单元，并尽可能让每个单元包含一个拷贝靶分子，进行PCR扩增后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，是一种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应，而非以模板CT值进行核酸定量的real-timePCR，该技术具有超高的灵敏度与精密度。这项技术在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面呈现出的优势已被普遍认可，而其在基因表达研究、microRNA研究、基因组拷贝数鉴定、癌症标志物稀有突变检测、致病微生物鉴定、转基因成分鉴定、NGS测序文库精确定量和结果验证等诸多方面具有的广阔应用前景已经受到越来越多的关注。

参考资料：载玻片APP、《中国体外诊断产业发展蓝皮书》