时至今日，很多研究者仍着迷于研究细菌CRISPR系统的功能，以及如何借助对相关机制的理解来产生新的技术。CRISPR系统目前在临床诊断与基因疗法中的研究成果也在不断涌出。近日，Sherlock Biosciences公司宣布其基于CRISPR技术的新冠病毒试剂盒已获得美国FDA的紧急使用授权。这是FDA首次批准基于CRISPR基因编辑技术的新冠病毒检测产品，也是首次授权使用CRISPR技术进行传染病检测。
一、CRISPR-Cas是细菌体内精妙的防护系统
CRISPR的全名是“规则间隔簇状的短回文重复序列”，最初在研究者细菌和古细菌的DNA中发现了这些序列，大小范围为23-47个碱基对。这些重复序列（repeat）被相似长度的间隔子（spacer）隔开。
Repeat是细菌固有序列，能够同时结合CRISPR相关性（Cas）蛋白和spacer序列，而spacer则是细菌（或是其祖先）感染过的病毒序列。一旦病毒感染发生，绝大多数的细菌死亡，极少部分的细菌由于其基因变异得以生存。这些细菌中的一部分，将病毒的DNA序列切割后，插入repeat区域中，形成spacer，从而获得类似高等生物“免疫记忆”的能力。当细菌被病毒再次攻击时，这些间隔序列会从整个序列排列中被转录出来，切割成为成熟的crRNA对Cas蛋白的复合物进行引导，切割病毒的核酸分子中的间隔序列前体（protospacer）。
crRNA招募效应蛋白的组成将其分为两级，1级CRISPR系统利用多个Cas蛋白与crRNA形成效应复合物，2级CRISPR系统利用单个大Cas蛋白与crRNA形成效应复合物。
需要注意的是，只有当间隔序列前体的两侧是由间隔序列前体临近基序（PAM）组成时才会发生切割，而在间隔序列两侧没有PAMs时不会发生。不同的Cas蛋白识别不同的PAM序列，有研究表明产脓型链球菌（Streptococcuspyogenes）中的SpCas9对病毒基因组的切割作用需要在病毒性序列作用目标下游有一个5'-NGG-3'间隔序列前体临近基序（PAM）序列的存在。
总而言之，CRISPR-Cas系统是一种RNA介导的适应性免疫系统。整个过程有点类似慕容复的“以彼之道，还施彼身”，你用DNA对付我，我用你的DNA把你杀死。 二、CRISPR-Cas临床诊断优势凸显
利用CRISPR酶的酶切特性，分子诊断技术有望在两个方向实现突破：一是对多种病原体实现高灵敏度定量检测；二是快速诊断，减少检测时间。Gootenberg等开发了一种改进的核酸检测技术，用于多重定量和高度灵敏的检测，并结合了侧向层析技术对核酸检测结果进行可视化。Myhrvold等通过添加样品制备方案，以快速检测临床样品中的特定病原体。
2016年，国内最有名的张锋实验室团队发现Cas13在单个crRNA的引导下，能够切割ssRNA或mRNA（类似于RNA干扰），实现基因敲低方面的应用。同时，Cas13还附带非特异性的ssRNA切割功能。其开发的SHERLOCK v1版方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团 ，通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。
2018年，张锋实验室团队的成果用简单的纸带（paper strip），以展示基因特征（genetic signatures）的测试结果。将纸带浸入处理过的样本后，会出现一条线，指示着目标分子是否被检测到了。通过对CRISPR酶学的表征和应用开发，实现了更快速、更灵敏的检测：1、检测下限低至2 attomolar；2、通过将Cas13与Csm6（一种与CRISPR相关的辅助酶）结合，使信号灵敏度提高3.5倍；3、SHERLOCK v2可以通过侧向层析检测登革热或Zika病毒单链RNA以及患者液体活检样品中的突变，突出了其作为核酸的可复用，便携式，快速和定量检测平台的潜力。
2018年4月，另一个知名团队Jennifer Doudna教授发现Cas12酶家族在gRNA的引导下与目标序列结合以后，便会切换为激活状态切割体系内其它的单链DNA（如含有报告基因的单链底物）。Cas12a这一特点可被用于分子诊断领域，实现对肿瘤基因或特定病原体的检测。Doudna教授将Cas12a靶向切割单链DNA的特性与重组聚合酶扩增RPA技术联合起。当加热到体温时，RPA会快速增加目标DNA的拷贝数，使Cas12a更容易找到并切割它，然后任意切割附近单链DNA，从而让报告分子发出荧光。
Doudna教授为了分析DETECTR方法的特异性和灵敏度，测试了25种人类肛门拭子的DNA提取物，这些样本先前已通过基于聚合酶链反应（PCR）的方法进行过HPV感染分析。在1小时内，DETECTR准确地鉴定了包含HPV类型异质混合物的患者样品中的HPV16（25/25）和HPV18（23/25），PCR结果与DETECTR荧光信号之间具有良好的相关性。这些结果证明了一种新的基于CRISPR的诊断平台，类似于使用CRISPR-Cas13a用于RNA检测的平台，并表明DETECTR原则上可以以高灵敏度和特异性检测任何DNA序列。
较为明显的是，RT-PCR的检测一般要等几个小时，还需要使用特殊设备、进行冷热循环；与之相比，DETECTR以及SHERLOCK v2技术只有两个固定的操作温度，大约45分钟后，就能像家用验孕测试一样，在可视化读出条上读取结果。具有良好的应用前景。
三、CRISPR与罕见基因病疗法
除了在临床分子诊断领域的应用，CRISPR基因编辑技术已应用于白血病、血友病等遗传病的基因疗法（gene therapy）取得多项进展。基因治疗是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，达到治疗目的。目的基因转移方法可分为病毒方法和非病毒方法两大类。由于CRISPR/Cas9基因编辑技术能作为向导把目的DNA送达靶位置，避免对正常功能基因的干扰，可减少不必要的突变风险。目前这项面临的主要挑战是将它送到体内的正确位置。
市场上主要的专注于基因编辑的3家上市公司为Editas Medicine、 CRISPR Therapeutics和Intellia Therapeutics，多家创业公司融资到B轮。但CRISPR基因编辑的发展并非一帆风顺。2018年5月，CRISPR Therapeutics公司与Vertex Pharmaceuticals的合作遭遇挫折，其共同研发的针对镰刀型贫血症的基因疗法CTX001在FDA的IND审查中受到临床试验暂停。近日获得进展，于 5 月 11 日宣布，（FDA）授予 CTX001 再生医学高级疗法（RMAT）资格，CTX001 是基于CRISPR研发出的一种研究性，自体基因编辑的造血干细胞疗法，将用于治疗严重的严重镰刀型细胞贫血病（SCD）和输血依赖性β地中海贫血（TDT）。
主要问题是由于目前广泛用于基因组编辑的CRISPR / Cas9方法涉及切割两条DNA链，在目标DNA序列中形成双链断裂。当用于纠正单个核苷酸时，会经常在目标位置引入随机插入或缺失（统称为indels）。消息一出，3家上市公司的股价均受到严重挫折。为了解决这个问题，David Liu及其同事的研究对Cas9蛋白进行了修饰，使其不再切割两条DNA链，但仍可以与目标DNA序列结合。通过将碱基修饰酶（APOBEC1）连接到Cas9，能够将胞嘧啶（C）直接转化为尿嘧啶（U），尿嘧啶（U）与胸腺嘧啶（T）形成碱基对。
结语 我们非常可喜地看到，CRISPR技术在临床感染诊断，液体活检和基因治疗方面都取得了不错的进展。如何能让CRISPR技术这把神奇的基因剪刀手变得准确率更高、编辑更有效，是CRISPR技术发展的主要方向。 |
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