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基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统(MALDI-TOF)在微生物鉴定中的应用现状

2019-12-15 11:43| 编辑: 小桔灯网| 查看: 3579| 评论: 0|来源: 检验前沿

摘要: 一、简介 质谱(MS)通过分析分子离子的质量电荷比(m/z)来鉴定和定量检测分子。质谱仪内的质谱可以解释为测定一个样本内不同分子的特性。质谱仪可以直接分析任何易电离的生物分子。MS的成功在于几个重要的发现, ...

一、简介


     质谱(MS)通过分析分子离子的质量电荷比(m/z)来鉴定和定量检测分子。质谱仪内的质谱可以解释为测定一个样本内不同分子的特性。质谱仪可以直接分析任何易电离的生物分子。MS的成功在于几个重要的发现,包括John Fenn发现的电喷雾电离(ESI)和田中耕一发现的基质辅助激光解吸/电离(MALDI)

    基质辅助激光解吸/电离(MALDI)的优势在于其样本与化学基质混合产生离子,使得样本分析前处理工作大大减少。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)结合了两个技术,包括基质辅助激光解吸/电离(MALDI)离子源和飞行时间质谱(TOF)。基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)的概念,质谱完全改变了临床微生物室中的微生物的鉴定方法,因为它是一个快速、高通量、低成本的以及高效的系统。采用MALDI-TOF MS可节省时间,因为细菌鉴定可以在一小时内完成,而不是24至48小时。这个时间对于潜在的自身免疫性疾病和免疫功能低下的患者是十分重要的。

    抗生素敏感性试验(AST)是影响临床治疗的另外一方面关键信息。因此也希望建立基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)快速可靠的药物敏感性的检测方法。已经开发和验证了几种关于药物敏感性检测的原理, 比如:(1)耐药性菌株生物标志物的检测;(2)抗菌素降解物的质谱检测;(3)稳定同位素(非放射性)标记的氨基酸检测等。但是这些方法都需要进一步优化以便有机会应用于常规检测。

    本文将详细讨论基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)的技术背景,包括样本制备和流程。然后介绍基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)在临床微生物鉴定中的应用、产生的毒力因子的分型、以及抗生素耐药性。此外,还讨论其在未来日常临床工作中的应用前景。

   

二、基于MALDI-TOF MS的微生物鉴定和样品制备


2.1、MALDI-TOF MS概述

    MS用于检测质/荷比(m/z比),MALDI-TOF MS提供样本中生物分析物的快速、准确和灵敏的光谱。MALDI是一种电离技术,其中基质吸收紫外线激光的能量从碎片最小的大分子产生离子。m/z比值可以由离子的飞行时间来确定,探测器测量离子飞行时间计算离子质量。


Fig. 1 e MALDI-TOF MS methodology. The sample is co-crystallized with the matrix on the sample target and to be desorbed and ionized by the MALDI ion source (e.g. ultraviolet laser). The ion molecules, including the microbial peptides/proteins, are accelerated by the electric field into the TOF analyzer. All the ions are separated by TOF in accordance with the m/z ratioand a mass spectrum.


a-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和2,5-二羟基苯甲酸是MALDI基质,用于各种微生物分析。对于微生物鉴定,采用分子量在2000和20000质/荷比(m/z比)之间带正电荷的肽/蛋白。不同种类的细菌间核糖体蛋白的序列和大小是高度保守的,因此可用于鉴定细菌的种类。每一个质谱峰可以用于细菌鉴定,并为细菌指纹提供有价值的信息。为了获得快速、准确、操作简单以及可靠的微生物鉴定,设计出了具有高度自动化操作流程和分析过程的新的质谱系统。


2.2、样本制备

    大多数细菌样本分开培养在一个固体琼脂糖培养基上,挑选单一菌落,直接在MALDI靶板上涂抹成一层薄膜。但需要注意,分枝杆菌属和丝状真菌通常需要多个步骤抽提以确保生物蛋白质组的质量,这样可以改进质谱图和鉴定的可信度。对临床急诊病例,采用MALDI-TOF MS可以对原始样本直接进行病原菌鉴定,许多体液样本需要进一步纯化,以便将病原菌与宿主细胞、多肽和蛋白进行分离。不同生物样本需要采用不同的制备方法和鉴定流程以便适应MALDI-TOFMS检测。


Fig. 2 e MALDI-TOF MS microorganism identification workflow in a clinical laboratory. All the bacterial colonies from a standard culture in a solid agar plate are applied directly via the standard smear method. Some liquid samples of urgent specimens, such as blood culture positive bottles and body fluids (CSF or urine), can be applied for direct identification after a multi-step sample preparation and extraction protocol. Mycobacterium spp. are applied following a specific sample preparation protocol for their rapid identification.


2.2.1、临床实验室样本一般制备流程

    理想情况下,临床实验室最好采用一种简单、快速、可靠的样品制备方法,完整的细胞质谱,也称为全细胞MS(WCMS),是一种通过MALDI-TOF MS获取微生物蛋白质谱数据的方法。单一细菌或者真菌菌落中的微生物直接涂抹在MALDI靶板上成一层薄膜,然后在上面滴加1微升a-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)(由50%乙腈和纯水配制的2.5%三氟乙酸制备)基质液。这个试剂可以从大多数细菌中抽提蛋白质用于MALDI-TOF MS检测。有些细菌,如分枝杆菌和某些酵母,被肽聚糖或荚膜层包裹,这意味着它们的内部蛋白质不容易被基质液抽提。这些样本建议采用乙醇-甲酸(FA)抽提方法以便产生高质量的质谱图用于鉴定和进一步分析。1接种环细菌加到300微升纯水中,再与900微升纯乙醇混合,震荡几秒钟,以便灭活病原微生物。高速离心2分钟,小心去上清,沉淀中加入总量20至50微升70%甲酸,并充分混合,然后加入等量的纯乙腈并漩涡几秒混匀。高速离心2分钟产生细菌颗粒,将1微升上清液加到MALDI靶板上。样本上滴加用1微升a-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质溶液,进行检测。


2.2.2、液体样本

    阳性血培养(BC)和各种其他体液主要是液体样本。阳性血培养可能包括血细胞、培养基、树脂或木炭等。去除血细胞和来源于宿主和培养基中的蛋白是MALDI-TO MS样本制备的关键。采用低速离心10分钟的方式去除血细胞,含有细菌的上清液则继续高速离心。去污剂,如皂甙和十二烷基硫酸钠(SDS)也被用来溶解血细胞。真核细胞可以被裂解,但原核细胞不受低浓度去污剂的影响。这个处理步骤可以缩短低速离心去掉宿主细胞的持续时间。也可以采用有欧盟体外诊断试剂注册证的血液培养样本制备试剂盒直接从1.5毫升 阳性血培养(BC)肉汤中进行微生物鉴定。纯化的细菌在MALDI-TOF MS检测前,通过甲酸抽提程序进一步处理。

    MALDI-TOF-MS鉴定细菌的敏感性为~104-105CFU大肠杆菌(菌落形成单位),方法敏感性和对纯化培养的要求取决于样本类型。尿标本可直接用于细菌鉴定。尿样本进行流式细胞仪检测以确认是否存在细菌。4毫升阳性尿液样本低速离心(2000Xg)30秒去除白细胞和上皮细胞,然后上清液经过高速离心(15500Xg)5min,收集细菌颗粒。MALDI-TOF-MS分析前用甲酸处理以便抽提细菌蛋白。以前有报道关于采用脑脊液(CSF)对细菌性脑膜炎患者进行病原菌体快速鉴定。用500微升脑脊液进行微生物鉴定。100微升13%十二烷基硫酸钠(SDS)添加到脑脊液中,震荡旋转10秒,然后在13000Xg离心2分钟, 将颗粒重新悬浮在1毫升纯水中,然后在13000Xg离心,MALDI-TOF-MS检测前,用甲酸处理洗涤后的细菌颗粒以便抽提蛋白。


2.2.3、分枝杆菌

    近几十年来,分枝杆菌属经历了大规模的分类逆转,目前已经识别菌种有190多种(bacterio.net/mycobacterium.html;Dec.2018)。结核分枝杆菌复合物群(MTC)引起肺结核病(TB)以及全球严重的公共健康问题。2016年,约1040万人结核病,170万人死于肺结核。许多非结核分枝杆菌(NTM)也已被确定为致病病原体,对免疫功能低下人群感染威胁越来越大。分枝杆菌的鉴定可以通过MALDI-TOF MS方法进行改进,因为与传统方法相比,MALDI-TOF MS方法提高了细菌鉴定的速度和准确性,成本更低。考虑分枝杆菌的缓慢生长时间,依赖于种群的传统的生化鉴定,从细菌菌落完全形成后进行生化反应,通常需要7-21天的时间。相反,MALDI-TOF MS技术在细菌形成的菌落适合于样本制备后可以数小时内可以得到相同的结果.  布鲁克 MALDI Biotyper公司(MBT, BrukerDaltoniksGmbH;Billerica,MA,美国)和Vitek MS(美国北卡罗来纳州bioMerieux公司)都有拥有自主分枝杆菌鉴定程序。分枝杆菌的失活是样品处理的关键点之一。布鲁克采用95加热块热灭活30分钟, 而生物梅里埃则应用与放在70%酒精中的硅珠3000转/分涡流混合(Vortex Genie 2[scientific industry] with MoBio Vortex Adaptor)10-15分钟。细菌颗粒与加在纯乙腈中的硅珠漩涡混匀1分钟或在70%乙醇中的硅珠漩涡混匀10-15分钟。通过旋涡混匀机械破碎后,样品按顺序用等量的70%甲酸和纯乙腈处理,在MALDI 靶板上滴加1微升提取物,干燥并用1 微升a-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)基质覆盖。


2.2.4、丝状真菌

    对于丝状真菌,文献报道了几种不同的培养条件和提取方法。 布鲁克 MALDI Biotyper流程建议沙伯劳液体肉汤应该边振摇边培养。实验室也广泛采用沙伯劳庆大霉素-氯霉素琼脂平板进行真菌培养,这种情况下,通常在27摄氏度下培养72小时。收集部分真菌菌丝体并用改良的甲酸提取方法进行蛋白抽提。在1.5毫升试管中,将300微升纯水和900微升纯乙醇与真菌样本中充分混合。13000Xg离心10分钟,去上清液,风干1小时。将干燥的样品在20-50微升70%甲酸溶液中孵育5分钟。然后加入等量的纯乙腈孵育10分钟后,将样本滴加到MALDI靶板上进行分析。


三、微生物分类和鉴定


    在感染性疾病治疗过程中,特别是临床样本中的病院微生物鉴定,临床微生物学实验室是临床医生的重要合作伙伴,细菌种类的鉴定可以指导抗生素的合理选择。在药物敏感性实验协助下,临床医生可以确定哪些抗生素是有效的、哪些抗生素可以成功控制感染。采用MALDI-TOF MS技术可以实现不同培养条件下分离的广谱临床微生物的高效和精准的鉴定。因此,对抗菌素治疗来说,一种快速而准确的抗菌鉴定方法是非常关键的。


3.1、培养皿中微生物鉴定

    MALDI-TOF-MS在微生物鉴定中的临床应用主要来自于培养皿。使用

这种方法,在几分钟内,用小量的微生物生物量(104-105细菌)可以对一大群不同细菌种类进行鉴定。用消毒的接种针从琼脂培养皿中人工挑选菌落,然后涂抹在一个不锈钢的MALDI靶板上,靶板上有高度规则的便于均匀加样的精细结构。样品干燥,添加少量基质,如HCCA,与MALDI靶板上的细菌样品共结晶,然后将样本放入质谱仪进行分析检测。

    综合比较性研究评估了MALDI-TOF MS的重现性和准确性。2001年,研究者比较了MALDI-TOF质谱仪和传统生化法对细菌的鉴定,结果显示99.1%的样本两种方法结果高度一致。另一项研究显示,MALDI-TOF MS鉴定凝固酶阴性葡萄球菌的总体正确率打到93.2%。2011年,研究显示MALDI-TOF MS对不同种类的葡萄球菌鉴定结果可靠(准确率达到99.3%),认为与基于rpoB的测序鉴定的标准方法相同。2012年,研究报道MALDI-TOF MS检测涵盖革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的296例菌株,其属(39属)和种(102种)的正确鉴定率分别为94.9%和83.4%。另一研究提示,与其他系统相比,MALDI-TOF MS是弯曲菌及其相关细菌鉴定首选。评价革兰氏阴性细菌的鉴定,2263种临床有意义的菌种可以采用MALDI-TOF MS鉴定出。Faron等研究显示MALDI-TOF MS鉴定多中心分离的的菌株属的正确率为99.8%(2258/2263),种的正确率为98.2%(2222/2263)。

     综上所述,MALDI-TOF MS被认为是一种适合于从培养皿中高通量微生物鉴定的十分准确的方法。


3.2 、阳性血培养微生物鉴定

    MALDI-TOF MS可以直接对血培养中分离的细菌进行鉴定。研究显示,MALDI0-TOF MS检测584例阳性样本,有562例检测出存在一种细菌。使用MALDI Biotyper的另一项研究结果显示,在181个单以微生物培养物中,属和种的阳性鉴定率为97.8%。然而,也有一些大的问题存在,当血培养中有多重细菌菌种时,只能鉴定一种细菌,从而出现错误。此外,它不允许用于某些特殊类型微生物的鉴定,包括草绿色链球菌和有荚膜的微生物,如克雷伯菌肺炎球菌和流感嗜血杆菌。如果直接分析血培养基,则人血中的成分可能干扰检测或者产生杂峰,因此,将血培养基进行预处理对降低干扰、浓缩细菌非常重要。为了解决这些问题,研发了MBT Sepsityper™试剂盒。一项有关Sepsityper™试剂盒研究显示,比革兰氏阳性微生物(100%菌属和67.7%菌种)更多的革兰氏阴性微生物(100%菌属,91.4%菌种)被准确鉴定。另外,研究报道了MALDI-TOF MS对厌氧菌、α溶血性链球菌和多种微生物情况的鉴定有难度。Arroyo等研究显示,采用MALDI-TOF MS 直接对单一微生物生长阳性的血培养中分离的200株革兰氏阴性杆菌进行鉴定,其属和种的鉴定率分别为94%(188/200),91%(181/200)。此外,Chien等研究证实MALDI-TOF质谱法成功直接对405例显示阳性的血培养中的细菌和真菌进行鉴定。其中对365例单一微生物生长的血培养分别有89.6%和72.1%正确鉴定到种和属水平,剩下的40例多种微生物生长的血培养,分别有82.5%(33/40)和92.5%(37/40)正确鉴定到种和属水平。而对于患者来源的血培养,则采用MALDI-TOF MS进行鉴定分析时,需要对样本进行预处理以除去非细菌蛋白。当采用MALDI-TOF MS进行血培养鉴定时,从血培养报警培养阳性到鉴定出微生物结果只需要半小时,且80%的血培养阳性标本可以得到一个可靠的鉴定结果。对于传统的血培养鉴定流程,阳性血培养样本需要根据不同的微生物种或者属,在琼脂板上分离培养过夜或更长时间。当得到菌液后,再用生化方法进行进一步鉴定。而质谱则可以直接使用1毫升的血液培养阳性肉汤,无需通过细菌培养,直接花大概30分钟进行样本制备,然后采用MALDI-TOF-MS进行检测。与传统生化鉴定方法相比,MALDI-TOF MS鉴定血培养阳性样本,可以节省生化反应时间24-48小时或者更长。目前医学实验室用户可以买到CE-IVD认证的样品制备试剂盒和软件。


3.3、患者尿标本直接微生物鉴定

    尿路感染,包括膀胱炎(膀胱/下尿路感染)和肾盂肾炎(肾/上尿路感染)是最常见的临床细菌感染的类型。对于急性和复查的尿路感染,及时诊断治疗十分重要。因此,减少微生物鉴定所需的时间非常重要,可以通过直接用尿液样本进行检测。一项研究结果表明,利用4ml尿样进行低速离心去除白细胞,然后以高速离心收集细菌,细菌沉淀洗涤后,直接滴加到MALDI-TOF MS靶板,91.8%的微生物种和92.7%微生物属可以被鉴定。另一项研究显示,MALDI-TOF MS可以可靠地对尿液样本中细菌CFU/ml低到103的样本进行直接鉴定。这些结果表明,MALDI-TOF MS是一种准确的尿细菌鉴定方法,在未来可以更广泛的应用。


3.4、分枝杆菌的鉴定

    分枝杆菌是一种在全球范围内造成严重的公共卫生问题的主要的病原体类型。分枝杆菌属于放线菌属,包括190多种。结合分枝杆菌是引起人类致死性最多的病原菌。几年来,由于自身免疫性疾病和免疫力低下患者增加,非结核分枝杆菌感染引起的疾病大大增加。

    结核分枝杆菌诊断的金标准是从人类分泌物中,比如痰液、支气管肺泡灌洗液或胸膜液中分离培养出细菌,并通过涂片显微镜检查确认。但是分枝杆菌的种类的鉴定具有很大的挑战性,因为结核培养和生化鉴定每一步时间都很长(7至21天甚至更长)。另外的诊断工具,包括痰涂片抗酸杆菌,都不如培养敏感。因此,为了改进患者的预后,分枝杆菌的鉴定需要更快、更准确的方法。近期,结果最近,测序和探测方法已经用于细菌鉴定,核酸杂交(NAH)或核酸扩增检测有助于疑似肺结核患者中属于结核分枝杆菌复合物群(MTC)的病原菌鉴定。

    研究显示,与核酸杂交方法相比,MALDI-TOF MS可以100%正确鉴定结核分枝杆菌,核酸杂交只能对38.5%的非结核分枝杆菌进行鉴定。菌株[41]。已经证实,在临床实验室,MALDI-TOF MS对结核分枝杆菌复合物群(MTC)鉴定有很高的灵敏度,且可以缩短鉴定时间,成本低。尽管MALDI-TOF MS对对结核分枝杆菌复合物群(MTC)的鉴定最经济快速,由于非结核分枝杆菌在临床上越来越重要,采用MALDI-TOF MS对肺结核分枝杆菌感染还需要进一步研究。有文献推荐方法可以减少MALDI-TOF MS鉴定鸟型分枝杆菌(MAC)的错误发生。另外,一些极为相关的菌种间由于有相类似的质谱图,不能用MALDI-TOF MS进行分离鉴定。例如,嵌合体分枝杆菌和胞内分枝杆菌两者就很难分辩。由于不同细菌亚型显示不同的抗生素耐药性,细菌的精准、快速鉴定对正确使用抗生素十分有用。研究表明,MALDI-TOF MS可以分别对87.3%(89/102)和62.8%(64/102)在固体培养基培养阳性的结核分枝杆菌菌株准确鉴定到属和种水平。


3.5、酵母和真菌的鉴定

    酵母菌和真菌感染是免疫抑制患者常见的并发症,因此与自身免疫性疾病、血液肿瘤、造血细胞移植和器官移植密切相关。侵袭性念珠菌病是一种常见病中心静脉导管相关感染,侵袭性肺曲霉菌病可导至肺炎、发热、胸膜炎胸痛和咯血症状。由于传统的酵母和真菌鉴定成本高、费时,近来MALDI-TOF-MS应用于酵母和真菌的常规鉴定被推荐。例如,研究显示,MALDI-TOF-MS在2683例临床酵母菌株中鉴定出41类特殊菌种,酵母菌株的正确鉴定率达到98.8%(2651/2683)。因此认为,与目前的基于DNA鉴定的金标方法相比,MALDI-TOF MS是经济、简单。

    对于丝状真菌,研究显示,MALDI-TOF MS在种的水平对菌株鉴定正确率可以达到95.4%;与生化方法比较,MALDI-TOF MS用于鉴定丝状真菌更加准确。与传统生化鉴定方法相比,MALDI-TOF MS更简单、快速、便宜、更精确,可以用来区分十分接近的真菌种类。未来持续增加真菌文库对维持其鉴定的稳定可靠性十分必要。


四、抗生素耐药性检测


    MALDI-TOF MS微生物鉴定技术常用于临床微生物学实验室。此外MALDI-TOF MS还可用于抗菌敏感性试验(AST)。许多科学家设计了用MALDI-TOF质谱分析AST的多种方法,本文主要详细介绍其中三种方法包。


4.1、抗生素降解检测

    这种方法主要用于检测β-内酰胺酶抗生素耐药。β-内酰胺酶抗生素的耐药性主要是由于β-内酰胺酶表达,β-内酰胺酶水解β-内酰胺环,从而使抗生素失活。通过β-内酰胺酶水解β-内酰胺环相当于加了一个水分子,这个反应导至18Da质量变化,采用MALDI-TOF MS非常容易检测到这个质量变化。采用临床分离的大肠杆菌模型菌株来开发方法。模型菌株用多种不同类型的β-内酰胺类抗生素处理,然后检测菌种来确定各菌株的抗生素明感性结果。研究显示,MALDI-TOF-MS可检测由碳青霉烯酶产生的碳青霉烯类化合物水解产物,说明MALDI-TOF-MS具有快速检测β-内酰胺抗生素耐药性的潜力。该方法也被用于直接检测血培养阳性样本碳青霉烯酶活性。这样能够更快决定抗生素治疗方案,加快感染控制措施的落实。研究显示,在某种情况下,当β-内酰胺酶活性太低或者酶的表达延迟时,MALDI-TOF MS检测结果可能为假阴性,需要将孵育时间延长到4小时以避免错误的产生。


4.2 检测抗生素耐药菌株的特殊标志物

    用采用MALDI-TOF WCMS(全细胞质谱)进行微生物鉴定相同的样本处理方法来进行抗生素耐药菌株的生物标志物检测。用cfiA阳性脆弱类杆菌菌株中可以检测到一些特定的信号,cfiA由B类金属-内酰胺酶编码,使脆弱双歧杆菌对所有的β-内酰胺类抗生素耐药,包括碳青霉烯类。几乎100%耐碳青霉烯类杆菌的cfiA均呈阳性。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是全球大多数国家的公共卫生与医院卫生的关键问题。能够快速鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医疗领域的一个重大改进。许多研究表明在在三个SCCmec基因盒的位置编码的一个PSM-mec小的肽段可以显示一个2415m/z处的信号,这个信号与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌高度相关。葡萄球菌耐甲氧西林有三个不同机制,37%耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有2415m/z处的信号。尽管该信号敏感性比较低,但特异性很高,达到》98%。这表明不经过任何其他的样本处理,这个峰对临床是有价值的。


4.3、细菌表型耐药性分析

    这种方法类似于微生物抗生素耐药性的表型观察。这个方法的好处是它比传统技术更快,因为只需培养2-3小时。原则上,它可以用来通过优化在抗生素存在下微生物生长而检测抗生素耐药性机制。当微生物与抗生素一起孵育时,细菌生长在含有同位素标记的氨基酸的培养基中。只有具有耐药性的微生物才可以生长而引入标记的氨基酸。通过带有标记的、重的氨基酸的耐药菌珠新合成蛋白质呈现与敏感和耐药菌株不同的质谱图。将耐药菌株质谱图与标准菌株相比较,可以在数小时内确定细菌的耐药性。


五、通过MALDI-TOF MS肽/蛋白质谱

进行细菌的分型


    传统的生化细菌鉴定仅提供种的结果。MALDI-TOF MS可用于获得菌株的蛋白质图谱。利用蛋白质图谱,可以有机会检测到与表型相关的生物标志物,如耐药菌株或类似物种的鉴定。细菌分型的方案是在细菌完成鉴定后,通过采用相同的细菌蛋白谱获得细菌分型信息。这个方法可以用于对耐药菌株的鉴定或者用于菌种复合体的精确鉴定。

    临床前抗生素耐药菌株检测可用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株。大多数cfiA阳性的脆弱类杆菌是碳青霉烯耐受性的。blaKPC阳性相关信号与产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌碳青霉烯类耐药株高度相关。菌种复合体的准确鉴定可以用于在基因和蛋白质谱水平显示仅有轻微差异的单核细胞增生李斯特菌群(包括单核细胞增生李斯特菌、李斯特菌伊万诺维等)。


六、MALDI-TOF质谱鉴定微生物的局限性


    目前MALDI-TOF-MS不适于鉴别志贺氏菌、大肠杆菌、百日咳杆菌、支气管炎杆菌等。阴沟肠杆菌复合体是一群具有相似耐药图谱,目前还不能分辩的的六个非常密切相关的菌种。此外,肺炎球菌、草绿色链球菌和有荚膜的微生物,如肺炎克雷伯菌和流感嗜血杆菌可能采用MALDI-TOF MS鉴定时会被错误鉴定。大多数这些细菌菌株可以通过采用参考谱来进行鉴定,但是,还有很一个小部分具有非常相似的遗传背景或者菌种间广泛多样性的菌珠不能通过质谱信号进行区分,继而获得可靠的鉴定结果。而且MALDI-TOF-MS鉴定丝状真菌的主要局限性在于参考谱。菌谱信息库的持续更新和样本恰当的富集方法是将增加在MALDI-TOF MS在微生物鉴定中的作用和应用潜力。


七、结  论


    MALDI-TOF MS是一项新兴技术,近年来已经广泛用于微生物鉴定。具有高通量、经济和高度准确性等优点。由于MALDI-TOF MS不仅可以鉴定生长在琼脂培养皿或者肉汤培养基中的细菌,而且可以直接对血培养阳性、尿标本以及其他生物样本中的细菌进行鉴定,该方法对常规微生物实验室是非常重要的。MALDI-TOF MS对微生物的鉴定的可靠性和准确性已经在许多研究中进行过验证,微生物鉴定的准确性十分依赖于数据库存入的数据数。因此,参考数据库的持续更新是保证数据先进性必不可少的。对数据库的进一步精细化将实现MALDI-TOF MS系统快速和可靠地对抗生素耐药特性进行鉴定,以及对尿样本和血培养样本直接进行鉴定,该技术在未来的临床微生物实验室具有很大的应用潜力。

参考文献
Journal of food and drug analysis.27(2019)404-414
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