试剂的稳定性是体外诊断试剂产品质量的一个重要参数，特别是对于化学发光试剂。化学发光试剂稳定性通常包括试剂的稳定性，校准品稳定性，质控品稳定性等。评价化学发光试剂的稳定性按照试剂稳定性的评价方法分类，则有实时稳定性，加速稳定性，运输稳定性以及在机稳定性。我局就影响化学发光试剂稳定性的因素专门做了一期探讨。
绝大多数化学发光试剂都是液相的，保存在以水为溶剂的缓冲液中。维持抗体（试剂）、抗原（校准品、质控品）在溶液中的稳定性，目的是在保存过程中维持蛋白质的结构和活性。蛋白质的空间结构可划分为四级。一级结构由氨基酸通过酰胺键连接序列组成。酰胺键非常坚固稳定，因此在蛋白质保存过程中，一级结构序列不太可能发生改变，但是长期保存过程中，氨基酸侧链可能会发生转化（如氧化、脱酰胺反应等），或者被水解酶降解。蛋白质的二级结构是依靠不同氨基酸之间的C=O，N-H基团的氢键形成的三维结构，最常见的是α-螺旋，β-折叠。蛋白质储存过程中变性与聚集通常与这两种结构的改变有关。通过多个二级结构在三维空间折叠形成蛋白质三级结构，通常将疏水氨基酸基团隐藏在蛋白质内部，而将亲水基团暴露在溶液环境中。蛋白质的四级结构则是不同亚基排列形成一个蛋白质复合分子结构，不是所有的蛋白质都有四级结构。蛋白质三级结构包括所有的非共价相互作用（不包括二级结构），决定了蛋白质的功能。微环境中物理、化学、热力学性质的改变能够影响蛋白质氨基酸残基、二级结构、三级结构的变化，继而引发蛋白质构象改变、折叠展开（变性），从而失去相应功能。因此，维持蛋白质的稳定性实际上是降低蛋白质在溶液中的分子运动，消除蛋白质构象转变，使蛋白质维持在天然状态。 在溶液中，蛋白质的结构不但由蛋白质本身分子结构决定，蛋白质与溶液中的溶质、溶剂的相互作用也能够影响蛋白质结构。因此，蛋白质的稳定性不但与自身结构有关，也与存储环境（pH，温度，盐离子浓度，表面活性剂等）相关。通过分析影响蛋白质稳定性的因素，调节蛋白质储存环境，对于蛋白质的稳定性有重要的意义。
△蛋白质变性
脱酰胺反应 脱酰胺反应是影响蛋白质稳定性的重要因素。脱酰胺反应是常见的蛋白质翻译后修饰，同时在蛋白质或多肽保存过程中也会发生自然的脱酰胺反应。脱酰胺反应能够将天冬酰胺（Asn）的氨基残基转化为羧基，从而将天冬酰胺转化为天冬氨酸或β-天冬氨酸。
△脱酰胺作用机制图：首先天冬酰胺残基与临近氨基酸作用形成一个五元环中间物——琥珀酰亚胺A；随后琥珀酰亚胺进一步水解生成天冬氨酸或β-天冬氨酸 蛋白质发生脱酰胺反应，其亲水性将发生改变，并且由于减少了一个氨基、增加了一个羧基，导至蛋白质负电荷增加。另外，脱酰胺反应中生成的琥珀酰亚胺中间物还容易引起多肽链的断裂。 蛋白质序列对脱酰胺反应的发生率有直接影响。当天冬酰胺临位氨基酸为甘氨酸（Gly）时，其更容易发生脱酰胺作用，其次是Asn-Ser，Asn-Thr（Ser，丝氨酸；Thr，苏氨酸）等。当天冬酰胺临位氨基酸为疏水氨基酸时，其发生脱酰胺的概率则大大奖低。另外，脱酰胺作用还与蛋白质环境有关，当蛋白质处于中性或偏碱性环境下时，天冬酰胺处于去质子化状态，更容易发生脱酰胺反应。 除了天冬酰胺之外，谷氨酰胺也能发生脱酰胺反应，但是发生率较低。目前对于蛋白质发生脱酰胺作用的原因未有明确定论，通常认为是蛋白质降解的信号。因此，蛋白质的脱酰胺反应是导至蛋白质活性损失的主要原因之一。它能够改变蛋白质局部亲疏水性，影响蛋白质电荷分布，改变蛋白质的空间结构，从而降低蛋白质活性。对于重组蛋白而言，脱酰胺反应影响巨大，一方面蛋白质中通常含有较高含量的天冬酰胺（~4%）；另一方面，重组蛋白一旦与宿主细胞分离，失去了修复机制，有可能在长期储存过程中发生脱酰胺反应。因此重组蛋白脱酰胺反应的研究对其稳定性、储存条件筛选，具有重要的意义。 氧化作用 蛋白质氧化作用是蛋白质失活或聚集的另一个重要因素。其中，半胱氨酸、甲硫氨酸、色氨酸等氨基酸残基尤其容易被氧化。为了提高蛋白质在长期保存过程中不被氧化，需要在缓冲液中添加一些还原剂，如DTT、2-巯基乙醇等。由于氧化还原电位较低，还原性强，DTT能够维持单巯醇试剂处于还原状态，并且能够定量还原二硫键。同时DTT不会形成二硫化物，因此DTT较2-巯基乙醇更为常用一些。另外常用的还原剂还有TCEP（三(2-羰基乙基)磷盐酸盐）。TCEP不易挥发，无特殊气味，在水中溶解度高达310g/L，并且不易被空气氧化。与DTT相比，在pH大于7.5条件下，TCEP更加稳定，且pH小于8时，TCEP还原性更强。 蛋白酶抑制剂及防腐剂 在蛋白纯化和保存过程中，蛋白水解也是一个重要的问题。一个普遍的观点是，蛋白纯化过程无法完全将蛋白水解酶完全去除，因此，在没有蛋白酶抑制剂地情况下，长期存放过程中，蛋白水解是不可避免的。
△常用蛋白酶抑制剂及100X混合配方：将配制好的各抑制剂原液取对应体积量混匀，加水定容至20mL，配制成100X的混合蛋白酶抑制剂 另外，在蛋白质长期存放过程中，微生物生长也有可能导至蛋白质水解失活，因此需要加入防腐剂，如叠氮化钠、邻乙汞硫基苯酸钠、ProClin 系列以及抗生素等。同时如果蛋白质对防腐剂敏感，或后期应用过程中不能存在防腐剂，则可以通过0.22μm滤膜进行灭菌。 蛋白浓度对稳定性的影响 蛋白存放过程中，浓度对蛋白稳定性也有重要影响。通常来说，蛋白质浓度低于50μg/mL时，稳定性较差。在低蛋白浓度条件下，多亚基蛋白、含有辅助因子的蛋白具有解离的趋势，并且蛋白质容易不可逆地吸附在容器管壁上，如玻璃、塑料等材质。特别是粘附性较强的蛋白质，其因管壁吸附而损失的蛋白质可能达到100%。通过在保存液中添加非离子型表面活性剂可以有效解决这一问题，如在缓冲液中添加0.02%（w/v）的Triton X-100，或Tween 20。相对于Triton X-100，Tween 20细胞毒性更小，且紫外吸收更弱，在应用上可能更为广泛一些。而在浓度过高时，溶液中也容易形成可逆或不可逆的蛋白聚集体，对蛋白的生物活性产生影响。
△高蛋白浓度下的蛋白聚集示意图
影响蛋白质稳定性的因素还有许多，我局也只是抛砖引玉的拆解了对蛋白质稳定性影响较大的四种因素。蛋白质稳定性研究是一个长期的、个性化的过程。每种蛋白质，甚至是同一个蛋白质，批次不同，其稳定性也会有所区别。蛋白质稳定性研究可是一个非常宏大的课题，后续我局还会进一步讨论蛋白质稳定性相关问题。 【参考文献】
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