IVD质量管理系列の技术篇 胶体金免疫层析法（下）

四、关键原辅料的质控标准

1.概述

免疫层析法试剂的产品实现过程涉及了多学科的交叉应用，如机械原理、流体动力学原理、免疫学原理、自动化控制、高分子材料等多学科的知识，因此对于生产质量管理人员而言，获得相关领域的认知，有助于我们更深刻的理解产品。以下主要针对硝酸纤维素膜、玻纤纤维垫、吸水纸、胶黏剂等胶体金试剂造成影响的主要物料进行介绍，这些技术资料非本人研究所得，因此对原创者在此一并致谢！

而在获得这些材料的相关信息的基础上，对于质量控制人员来讲，需要进一步来建立一套自己的控制标准、检验方法。可能这些需要一段时间的摸索和验证，但这些工作是非常有必要的。

2.硝酸纤维素膜关键指标及控制

2.1膜对于免疫层析试剂条可能是最为重要的材料，必须可以在检测线和质控线处不可逆地结合捕获性试剂。具有代表性的膜和它们的结合特性见下表：

2.2毛细管液流速率：是指从膜条的一端加入样品，样品前沿沿着膜条移动的速度。

这个值非常难以准确测量，因为这个速率随着液体沿着膜的移动的更远而指数性地下降。从x厘米移动2x厘米所花的时间通常是从0厘米移动到x厘米所花的时间的两倍。换句话说，就是如果花1分钟移动1厘米，那就要多花2分钟来移动第二个1厘米。这个现象意味着，检测线的定位对可以达到的灵敏度有着重要的影响。当捕获线定位在离起点比较远的地方时，被检测物经过捕获线时候的速率就比较慢，溶液中被检测物的有效浓度就比较高。由于这个原因，将捕获线定位在试剂条上相对远的位置是有好处的。一个可以简单测量的参数是毛细管液流时间，它是指液体用来沿着并且完全充满固定长度的膜条所需的时间。这个值以秒/厘米表示，以液流速率成反比。

2.3膜的蛋白质容载能力：取决于膜可用于固定蛋白质的聚合物的表面积。膜的面积由孔径、孔隙率、厚度等参数决定。

孔径：孔径是指在过滤方向上，也就是穿膜方向的平面方向上，最大的孔的直径。常用起泡点来测定。而膜生产过程，可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的。 

孔径分布:孔径是最大的孔的直径，而孔径的分布是指孔径的分布范围。具有相同孔径的膜，孔径的分布可能会非常地不同。在这种情况下，孔径不能预示毛细管液流速率。

孔隙率：是指在膜的三维结构中的空气体积，通常以膜的总体积的百分比来表示。例如，一张1厘米X1厘米X0.0014厘米的膜的体积是0.014厘米3，如果它的孔隙率是70%，那么构成孔隙的空气体积是9.8微升（0.014ml*70%）。孔隙率通常与孔径无关并且不受其影响，这两个参数本质上是独立。空气的体积也表示为膜的床体积和空间体积。膜或者其他有孔材料的空间体积可以用来计算使其完全湿润所需的液体试剂的总体积。

厚度：膜的厚度是重要的，有四个原因：影响床体积；影响检测线和对照线的宽度；影响拉伸强度；以及影响信号的可见度：

对床体积的影响：床体积是直接和厚度有关系的。当厚度增加时，床体积随之增加，因为试剂条的三维空间等于长乘以宽乘以厚度。对于一个宽1厘米长5厘米厚130微米（0.013厘米）的膜，它的总体积等于0.065厘米3。如果膜的孔隙率是70%，床体积等于45.5微升（0.7×65微升）。如果厚度降到110微米，床体积就减少到38.5微升，相反地，如果厚度增加到150微升，那样床体积就增加到52.5微升。如果用于检测的样品的总体积取决于膜的床体积，从52.5微升变化到38.5微升，减少了27%，这个变化是很显著的。如果对检测条的设计要求在膜的末端使用吸收垫，那样就不用着重考虑床体积。在这些环境下，膜可以承载的样品体积主要受吸收垫的床体积支配。同样地，被分析的样品体积可能不和可以产生检测信号（灵敏度）的样品体积成比例。床体积直接和孔隙率成正比，而孔隙率和密度成反比。这三个参数以同样的程度发生变化。

对检测线和对照线的宽度的影响：由于床体积随厚度增加，检测线和对照线的宽度也能被影响。在大多数情况下，捕获性试剂在每单位长度上以不变的体积被添加到膜上。液体被吸收到膜里，在孔内等体积取代空气。液体通常是先渗透入膜，然后横向移动。在较薄的膜上的试剂扩散会比在较厚的膜上的强，因为液体向下渗透的深度相对较小。如果相同数量的捕获性试剂在一个较宽的面积内扩散，探测性试剂也会同样地分散，最终结果是颜色较浅和灵敏度较低。

对拉伸强度的影响：拉伸强度是指能使膜破裂的力度，它随着厚度的下降和孔径的增加而成比例地降低。应用于免疫层析的膜非常敞开，如果没有附着在非有孔结构的胶片上，或者以网支撑，它们是极度脆弱的。膜的脆弱性令它们难以在操作时不被弄破，尤其是从100米长的膜卷切成2.5厘米宽的膜条时。由于这些原因，有支持物的膜具有比较好的拉伸强度，在常规的操作中不大可能被弄破。

2.4如何对NC膜进行质量控制：

• 查收COA
在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。

• 检查物理性能 
膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度，长度不需要检测。使用中可以关注膜上是否有断面重接现象， 断面多费料则多。厚度，由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均值（这个参数通常表示为膜上某个单独点的，包含可以接受的最大值和最小值的一个平均值。如果有塑料支持物，对它的厚度也应当单独进行描述。）。厚度是必测的参数，主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响流速。

• 跑水性能 
样本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易观测，需制作一个简易支架。操作：注入足够溶液到下部槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。这个参数通常表示为对于某个单独点的，包含可以接受的最大值和最小值的一个平均值。要规定进行毛细管液流检测所用的溶液，并且在QC测评中统一使用。进行检测的房间的湿度和温度也要受控。

• 点样测试 
C/T点样，其他试验条件相同情况下，记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。

2.5推荐的储存条件：

硝化纤维膜不需要特殊的储存条件。然而它们应当避免暴露于有机溶剂的蒸汽。被硝化纤维膜吸收的有机溶剂可以使膜变得疏水。建议膜应该保持密封于包装内，防止暴露于尘埃及污垢。至于长期储存，温度应介于15-30℃之间，相对湿度应该在15-85%之间，并且避免暴露于含冷凝水的空气中。

2.6 NC膜的供应商：
MILLIPORE（美国）、 WHATMAN and S&S、 SARTORIUS（德国）、伊能（国产）、MDI（印度）。

3. 玻璃纤维、聚酯纤维（用于制备样品垫、结合垫）关键指标及控制

• 厚度：可以用微米、毫米或者千分英寸（mils）来表示。变化范围也很重要，因为它会影响床体积和外壳所产生压力的均匀度。长和宽也需要进行控制。

• 基本重量：（毫克/厘米2），乘以厚度（厘米）得床体积（微升/厘米2）。床体积直接和孔隙率成正比，而孔隙率和密度成反比。这三个参数以同样的程度发生变化，所以基本重量的变化等同于床体积的变化。床体积是最重要的性能参数。

• 拉伸强度:基于和膜同样的原因，结合垫的拉伸强度是重要的参数。某些材料的脆弱程度和没有支持物的膜一样。因为它们可能要被切成1厘米宽或者更窄。

• 可萃物（可溶出物）：一些用来制作结合垫的材料可能含有粘合物，以使纤维聚在一起。另外，有些纤维可能折断或者和垫子的宏观结构分离。因此，垫子的相当一部分成分会在不同的加工过程中脱离。当使用检测条时，这些物质会导至堵塞，或者在样品湿润样品点并且移向下游时只有很少液体能转移。在纤维材料的生产过程中包被有相关物质，则在样品迁移过程中有可能会有可溶物带入，影响样本的检测结果。

4. 血液过滤材料

检测在血清里的被检测物，对于免疫层析检测条来说一个很必要的性能是，可以用来检测全血样品的能力。多孔介质可以从血清或者血浆里分离出细胞，产生足够的可以用于免疫层析分析的样品。从血清中有效地分离出细胞非常困难。血液里含有35%-45%的固体，大多数是红细胞，意味着如果分离效率是100%，那么200微升的血液里将能获得最多130微升的血清。过滤材料必须能够对各种情况的血液起作用，可以重复地并且以一样的液体动力，获得足够的血清，以充满整个检测条的床体积。即使有许多可以用来进行血液过滤的商品，但是它们并没有被横向流检测条广泛地接受作为成分之一。

5. 吸水纸（吸收垫）关键指标和控制

• 厚度：可以用微米、毫米或者千分英寸（mils）来表示。变化范围也很重要，因为它会影响床体积和外壳所产生压力的均匀度。长和宽的范围也应进行控制。

• 基本重量：（毫克/厘米2），乘以厚度（厘米）得床体积（微升/厘米2）。床体积直接和孔隙率成正比，而孔隙率和密度成反比。这三个参数以同样的程度发生变化，所以基本重量的变化等同于床体积的变化。床体积是最重要的性能参数。

• 拉伸强度:基于和膜同样的原因，吸收垫的拉伸强度是重要的参数。它们可能要被切成1厘米宽或者更窄，对其进行流水线带上操作会比较困难。

6.（PVC）粘贴底板的关键指标和控制

为了在生产中便于加工，构成检测条的多孔材料通常粘贴在粘贴底板上。粘贴底板由3个部分组成：塑料支持物，粘贴剂，以及保护膜。塑料支持物的维度(长，宽，厚)及其所允许误差必须进行控制。如果完成了的检测条要被放在外壳内，那么塑料支持物的厚度也必须一致，以使多孔材料不会受到不同程度的压力。

粘贴剂层要和对检测结果有影响的化学成分及材料直接接触。要详细说明的关键参数包括厚度、可萃物、挥发成分、粘度和有效期。如果化学物质在将膜粘贴在粘贴片上以后才再膜上划线，那么塑料支持物的厚度变化、粘贴剂层、和膜必须一同考虑，总体厚度的变化或者不均匀，导至划线的不一致。胶黏剂的挥发性可能会影响检测结果，因此制备成试剂条进行功能性检测，是一个直接的方式。

对于保护膜，要对其上的切刻线的定位和误差范围进行详细描述。要避免保护膜和膜直接接触。为了方便撕开保护膜，许多保护膜上面都会涂上一层以硅树脂为主的复合物。这些复合物会转移到膜上，表现为膜的上表面的疏水性。这里要特别强调的是，如果这个规律成立，保护膜上的硅树脂会影响后面划膜的质量，要特别杜绝使用保护膜去接触NC膜表面。

7.外壳的选择和规格

很多横向流检测条都被放置在塑料外壳内，即使这个外壳不是必需的。外壳可以防止使用者将样品添加在样品垫意外的位置。用于尿液检测的非处方产品，塑料外壳也可以保护检测条，防止由于不当操作导至液体飞溅到膜上。塑料外壳表面上的标识也可以指示检测线和对照线，并提供其他信息。

外壳可以固定做成盒子型，也可以根据用户定制设计成适合于检测条的结构。在二者间作选择时，要考虑单位价格、设计成本、与检测条在尺寸上符合性、以及对外壳外部标识的要求。最后，外壳内部部件的维度及其误差范围必须同构成检测条的材料的维度及其误差范围一致（备注：样本垫、金标垫、NC膜和吸收垫这四个关键位置与外壳内部部件接触部位必须考虑误差一致）。外壳内部的卡子和插座用来将检测条固定在对应于加样口和观察口的恰当的位置。它们使各种材料在进行检测时相互之间紧密接触。如果这些部件太大了，垫子和膜就有可能被压到使横向液流被阻断。外壳所使用的塑料也必须是生物兼容的。

关键的是外壳的内部设计要考虑流体动力学模型，外壳对试纸条的液体流速的影响降至最低。任何外壳内部设计的变更均要考虑由此带来的液体流速的变化，此变化可能是致命的，影响了试纸条灵敏度和特异性。在组织体系内，应当在完成试纸条的研制后，成立专门的工作组对外卡的设计进行研究。

8. 胶黏剂的影响

（在PVC板、箭头标签、粘贴胶带、手把标签中运用）

胶黏剂迁移对层析检测的影响：当产品开发者使用相关硬度太低的胶粘剂时，多孔材料会受冷流影响。而当胶粘剂的相关硬度增加后，迁移渗透的程度会降低。

胶粘剂的最大程度的渗透会造成大量相关的影响。例如，最小硬度的胶粘剂（RHC）不仅有最大的渗透程度，而且会造成标本迁移时间的显著提高并产生大量的疏水斑块。

另一方面，太高的冷流程度会造成孔隙堵塞、局部疏水及产品复溶问题的现象，这些现象也会干扰产品的性能。这些现象主要是由于产品各组分粘合好后胶粘剂迁移渗透到多孔物质里而引起的，尤其是在长效期的储存过程中。

胶粘剂迁移也会发生在一些特定的产品中，该产品的膜上附有一层起保护层作用的塑料薄膜——这是一种越来越广泛使用的产品模式。当胶粘剂垂直渗透迁移发生在有背衬膜产品时，它所造成的影响要比同样发生在无背衬膜产品上的影响更显著。过度的胶粘剂迁移会阻碍可视化检测线的加强，导至该检测线的强度明显降低。

参考文献：   

1.《丁香园.胶体金文献翻译专辑》,2007年

2. 《strips considerations for product development》.Millipore