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行研丨单细胞多组学高通量测序平台

2019-9-10| 编辑: 面气灵| 查看: 199| 评论: 0|来源: 探针资本

摘要: 目录《单细胞多组学高通量测序平台》1单细胞多组学高通量测序技术简介 1.1 单细胞组学技术发展历史 1.2 以RNA-seq为例介绍高通量单细胞测序技术 1.3 其他单细胞测序技术2高通量多组学单细胞测序平台的应用 2.1 ...

目录


《单细胞多组学高通量测序平台》

1 单细胞多组学高通量测序技术简介

    1.1 单细胞组学技术发展历史

    1.2 以RNA-seq为例介绍高通量单细胞测序技术

    1.3 其他单细胞测序技术

2 高通量多组学单细胞测序平台的应用

    2.1 以研究为目的的应用

    2.2 以临床为目的的应用

    2.2 以工业为目的的应用

3 竞争格局


单细胞多组学高通量测序技术简介


通过测序手段检测细胞多层次信息,如基因组、表观组、转录组甚至蛋白组已经成为生物学研究的重要手段。几乎一切生命体的活动都围绕着DNA->RNA->蛋白质的过程,而现有的组学技术也围绕这一过程获取信息(如DNA层面的基因序列),从而解读生物体运行机制,应用于疾病的诊断和治疗中。

多组学研究肿瘤 探针资本整理


探针资本根据公开资料整理


通过多维的测序技术可以获得组织样品的基因表达、调控信息,然而组织中仍有不同功能、形态的细胞,通过大量细胞混合样品测序只能得到组织的平均状态,而无法获得每个细胞的信息,为了解决这一问题,各个组学技术的单细胞测序技术应运而生,并且在近10年的发展中有了突破性进展,被广泛应用于肿瘤研究,甚至临床应用中。

2010-2019年PubMed “single cell sequencing cancer”主题文献数量 探针资本


1.1单细胞组学技术发展历史

单细胞组学技术中以单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing)应用最为广泛。蛋白质是生命活动的承担者,而蛋白质的时空表达等信息均可由RNA反映,所以通过检测细胞内RNA的表达可以有效反映细胞状态。自从1991年第一篇使用array技术测量RNA表达的文章发表以来,对转录组(狭义上则指细胞所能转录出的所有信使RNA,mRNA)的研究技术经历了Array(1991)-> RNA sequencing(2008)-> single-cell RNA sequencing(2009)的发展历程。目前针对不同需求,呈现RNA sequencing和single-cell RNA sequencing并存的状态。

测序方法发展史 资料来源:Molecular Cell 探针资本整理


虽然single-cell sequencing的方法仍在不断推出,但是目前使用最为广泛、商业化成熟的方法仍是10×Genomics公司推出的ChromiumTM系统。


1.2以RNA-seq为例介绍高通量单细胞测序技术

单细胞测序的最主要难点是如何在短时间内分离得到最可能多的单个细胞,早期的技术代表Fluidigm C1平台大约在几个小时中可以捕获96个左右的细胞,之后再进行建库和测序。而现在主流测序平台10×Genomics则是基于类似2015年发表的drop-seq技术原理得到单细胞,细胞准备时长在2小时左右,可捕获500-10000个细胞,在时长和细胞数量上都远远优于C1技术。


1.2.1 10×Genomics技术介绍

10×Genomics公司推出的ChromiumTM系统其技术核心是油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead in Emulsion, GEM)。该技术可以解决核心难点:快速高效分离细胞并将细胞和下一步反应所需试剂混合。该系统有75万种带有条形码的凝胶珠(barcoded gel beads),每个凝胶珠上有40-80万探针。每个探针含有四段各司其职的重要序列,下面对四段序列一一介绍。

凝胶珠示意图 图片来源:10×Genomics文档 探针资本


探针资本整理


带有条形码的凝胶珠通过横向孔道进入微流体“双十字”交叉系统,在第一个十字处,细胞通过纵向孔道运至交叉处,细胞与凝珠通过碰撞吸附在一起,继续行进至第二个十字处,进入油相,包裹形成油滴。通过此过程完成单细胞的分离和混合反应试剂的重要步骤,即含Barcoded RT Primers的Gel Beads、细胞和酶的混合物,三者结合形成GEMs,即包裹Gel Beads、细胞和酶的混合物的油滴。

10×系统GEM形成流程 资料来源:10×Genomics官网 探针资本


GEM形成后,细胞裂解,通过一系列反应构建文库,构建好的文库即可通过高通量测序仪测序获得序列信息,根据序列的BC可将序列分至一个个单细胞,根据UMI,可去除掉PCR扩增引入的重复,获得每个基因的准确表达量。具体建库流程如下:1)凝胶珠溶解释放大量barcode序列;2)随后mRNA逆转录产生带有Barcode和UMI信息的cDNA;3)油滴破碎,cDNA为模板进行PCR扩增;4) cDNA打断、加测序接头等传统二代测序的建库过程。


10×单细胞建库流程框架 探针资本整理


10×单细胞建库流程 10×Genomics官网 探针资本


1.2.2其他主流技术介绍:BD Rhapsody平台

BD在单细胞捕获时不再采用微流控孔道技术,而是使用CytoSeq蜂窝板技术,通过超过量的微孔保证细胞极大概率被单个投入微孔中,从而达到了分离单细胞的目的。在分离得到单细胞后,进行细胞裂解,反转等常规建库流程。

BD Rhapsody平台 单细胞mRNA抓取过程 图片来源:烈冰科技


1.3其他单细胞测序技术

1.3.1 Single-cell ATAC-seq

染色质开放性测序技术(Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing,ATAC sequencing)是借助转座酶获得染色质开放性区域序列的高通量测序技术。该技术于2013年,由美国斯坦福大学的William Greenleaf教授研发。基因表达需要相关蛋白(转录因子TF)结合染色质DNA,打开DNA双链之后,再由RNA合成酶介导合成RNA。染色体绝大部分区域是紧密折叠的,仅有一小部分比较松散,而这部分松散(开放、易接近)区域往往是转录发生调控区域,是研究基因表达调控的重要区域。转座酶可以接近并且结合在松散DNA上,通过改造使其携带并将接头序列插入在基因组的开放区域,再通过特异性结合接头序列的引物扩增片段,高通量测序之后便可获得转录因子结合位置,开放程度等转录调控的关键信息。

ATAC Sequencing 原理 图片来源:Genewiz 探针资本


10×Genomics开发的The Chromium Single Cell ATAC Solution是基于Chromium系统,思路与单细胞转录组测序相似,不同之处是样品为细胞核,并且在制备样品时加入转座酶进行插入和连接接头步骤,之后使用相同的流程完成单细胞核建库。

10×Genomics ATAC-seq 流程 图片来源:10×Genomics官网


1.3.2单细胞甲基化测序

DNA甲基化(DNA methylation)是DNA化学修饰之一,指DNA的CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位在DNA甲基化转移酶的作用下,共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化是研究最为广泛的表观修饰,DNA甲基化修饰的存在使得相同序列可以具有不同功能,获得修饰的胞嘧啶所在区域的结构、DNA构象和稳定性等都会受到改变,从而影响基因表达。


DNA甲基化修饰(DNA methylation)检测方法按照是否使用亚硫酸盐可以分为两类,其中金标准是亚硫酸盐测序(bisulfite sequencing)。DNA经亚硫酸盐处理后,非甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变。经过PCR扩增、测序等步骤,并与参考序列(未经处理)的序列进行比对,若参考序列为C,而测序结果中为T,则判断是未发生甲基化的位点;参考序列和测序结果均为C,则判断是发生甲基化的位点。

亚硫酸盐测序示意图 图片来源:diagenode官网


由于亚硫酸盐会导至DNA降解,使得单细胞水平低起始量的甲基化测序难以实现。直至2013年,汤富酬团队发明了单细胞RRBS(single-cell Reduced representation bisulfite sequencing)技术。该技术通过将所有反应整合在一个体系中完成优化了实验方法。

Single-cell RRBS流程 图片来源:Genome Research


虽然亚硫酸盐导至DNA降解的问题被缓解,但其仍然存在,并且不同位点转化的比例差异较大,使得检测得到的结果并不稳定。而利用APOBEC胞嘧啶脱氨酶选择性将没有修饰的C变为U,最终测序为T,与参考序列比对,则可得到甲基化位点。该方法使用甲基化修饰酶对DNA损伤小,但由于酶对于C的修饰效率受限,基于酶的测序方法需要根据片段大小调整酶量,从而获得较高的分辨率。

亚硫酸盐测序和Enzymatic Methyl-seq对比

图片来源:New England Biolabs 官网


1.3.3单细胞蛋白组测序

质谱(Mass Spectrometry,MS)是目前最常使用的蛋白质组学分析技术,它无需标记,可分析整个蛋白质组。然而质谱的灵敏度不高,检测群体细胞蛋白质组时,通常需要上万个细胞的蛋白总量,所以在检测单细胞时,由于单个细胞内蛋白质含量大大降低,使用质谱法检测单细胞蛋白质组仍需要方法上的改进。

2011年,来自斯坦福大学的Sean C. Bendall等人结合质谱技术和流式细胞技术,发明了质量流式细胞术(CyTOF),其原理如图所示,首先利用含不同过渡金属同位素标签的抗体标记细胞内的特定蛋白,被标记好的细胞随后进入质谱流式细胞仪,逐个喷出单细胞微滴,进入电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)装置,通过定量过渡金属元素标签从而得知每个细胞中各个结合蛋白的含量。由于金属离子的非特异性结合极低,方法的敏感性大幅提升。

CyTOF技术流程 图片来源:Proteomics


2017年,来自UCSF的Payam Shahi等人开发了Abseq,与CyTOF相同的是,Abseq利用特异性的抗体结合待测蛋白,不同之处是抗体使用DNA序列的标签标记,可通过高通量测序平台检测单个细胞细胞膜蛋白质的标签序列含量,定量蛋白质。位于美国三藩市的Mission Bio公司已将注册了Abseq技术。

Abseq流程图 图片来源:Scientific Reports


Abseq的优势是可以与其他组学检测联用(例如转录组),同时获得单细胞多维信息。BD公司也开发出类似的技术,并已将Abseq纳入qixia单细胞分析产品Rhapsody,可以同时分析单细胞的转录组和膜蛋白质组。

BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System 工作流程 图片来源:测序中国


类似的,10×Genomics也推出了基于类似原理的单细胞膜蛋白和转录组同时检测的系统。

10×Genomics 膜蛋白测序示意图 图片来源:10×Genomics官网


1.3.4单细胞免疫组测序

免疫组库(Immune Repertoire,IR)是指在特定时刻个体体内循环系统中所有功能多样性B淋巴细胞和T淋巴细胞的总和。T细胞和B细胞分别通过其表面的T细胞受体(TCR)和B细胞受体(BCR)来识别和结合抗原,进而发挥清除病原体或体内肿瘤细胞的功能。


BCR和TCR结构 图片来源:Cancer Letters


2009年三个实验室独立使用高通量测序的方法检测了个体的免疫组库。免疫组库高通量测序(Next-Generation Immune Repertoire Sequencing),通过特异性扩增(多重PCR或SMART RACE法)TCR/BCR全长或CDR3区序列(主要是TCR的β链或BCR的重链),再通过高通量测序,即可获得个体的免疫组库信息。扩增基因组DNA序列可以研究基因重组信息,扩增RNA序列可以研究表达信息。单细胞的免疫组高通量测序可以提供单个细胞内IgH:IgL和TCRα(γ):TCRβ(δ)的配对的情况。

单细胞免疫组库测序流程 图片来源:Cancer Letters




高通量多组学单细胞测序平台的应用


2.1以研究为目的的应用

2.1.1肿瘤细胞精确分类

单细胞测序较之前群体细胞测序的最大优势是多了每个细胞的信息,其最早在肿瘤方面研究的的应用是分析细胞异质性,通过检测单细胞转录组,根据基因的表达信息对细胞进行分类,表达相似的细胞被聚在一起,进而可以寻找稀有细胞类型,如肿瘤干细胞等。

在2014年发表于Science的一篇报道中,首次使用了单细胞转录组测序技术测量了脑胶质母细胞瘤的单细胞转录组,并根据转录组信息对细胞进行了分类。尽管大部分细胞按照肿瘤组织来源聚在一起,仍有部分细胞在聚集簇之外,说明肿瘤细胞之间异质性较大。

单细胞转录组研究肿瘤异质性研究 图片来源:Science


2018年8月10日,英国剑桥大学韦尔科姆基金会桑格学院研究所发表了一项针对肾脏细胞和肾癌的研究。该研究通过分析72501个肾组织细胞的转录组数据,并结合了对应肾癌组织的全基因组测序数据,鉴别了正常的肾细胞和癌变的肾细胞,描绘了人类肾癌各组分及对应的细胞特征。

肾脏细胞聚类图 图片来源:Science


针对各类肿瘤组织,以单细胞转录组数据为切入点研究肿瘤细胞异质性或其他问题的文章源源不断。据2018年10月发表的一篇单细胞转录组数据库CancerSEA收集的数据来看,覆盖的组织包括脑,髓骨,肾,乳腺,肺,皮肤,肝等,共计49篇研究文章,测量了128518个单细胞。


2.1.2肿瘤微环境的研究

肿瘤块不仅包括异质的癌细胞群,还包括各种驻留和浸润的宿主细胞,分泌因子和细胞外基质蛋白,统称为肿瘤微环境(tumor microenvironment)。肿瘤进展受到癌细胞与其环境的相互作用的深刻影响。肿瘤微环境对于原发性肿瘤是否被根除,转移或建立休眠的微转移至关重要。肿瘤微环境还可以形成治疗反应和抗性,也提高了对肿瘤微环境研究的需求。

肿瘤免疫治疗中,肿瘤浸润T淋巴细胞发挥核心作用。基于免疫检查点(如CTLA-4,PD-1/PD-L1)开发的抑制剂药物虽然在多种肿瘤治疗中取得良好疗效,但是不同类型肿瘤病人的疗效差异较大。近期小鼠模型实验证明肿瘤外部的T细胞可以参与系统性抗肿瘤免疫反应,不同状态的CD8+T细胞会导至免疫检查点抑制剂的治疗效果差异显著,这暗示T细胞的迁移潜能和状态变化特性,可能对其抗击肿瘤发挥至关重要的作用。

2018年,北京大学张泽民课题组开发了STARTRAC(single T cell analysis by RNA sequencing and TCR tracking)的生物信息学分析方法并使用该方法系统性地刻画了来自12个结直肠癌病人的11138个T细胞的组织分布特性、克隆增生、迁移和状态转化关系。该项工作属于国际开创性研究,为研究其他疾病中的T细胞以及开发新的治疗方案提供了思路。

T cells分类图 图片来源:Nature


同年,美国纪念斯隆-凯特琳肿瘤中心团队,使用单细胞转录组测序,分析了人乳腺肿瘤以及配对的正常乳腺组织,外周血和淋巴结4个组织来源的共47016个免疫细胞的基因表达特征。揭示肿瘤内淋巴细胞和髓系细胞的异质性,这种异质性通过各种环境刺激反应引起的组合基因的表达,且TCR的特异性参与了T细胞组合基因表达的形成。研究发现的T细胞状态的连续性变化颠覆了之前较少分化或激活离散状态形成的肿瘤微环境的经典概念。

乳腺肿瘤研究实验设计、方法和主要结论 图片来源:Cell


2.1.3发掘生物标志物

肿瘤标志物是指特征性存在于恶性肿瘤细胞,或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质,或是宿主对肿瘤的刺激反应而产生的物质。肿瘤标志物能够反映肿瘤发生、发展,监测肿瘤对治疗反应。

癌细胞的广泛异质性影响了患者的治疗效果和存活率。基于单细胞的分析方法可以检测个体单个癌细胞中的分子变化。因此使用单细胞技术可以发现更具特异性的生物标志物。

如下图所示,使用单细胞技术,获得肿瘤组织的多维数据(基因组,表观组,转录组和蛋白组)后,进行功能性分析,确定肿瘤的分化、繁衍、转移等特性,从而鉴定出生物标志物。

使用单细胞测序方法鉴定肿瘤标志物流程

图片来源:Journal of Cellular and Molecular Medicine


2017年,加州大学圣地亚哥分校人类基因组医学研究所所长张康教授和中山大学肿瘤防治中心徐瑞华教授团队通过检测和分析肝癌样本和正常样本的基因组甲基化水平,再使用深度机器学习,构建了预测生存率的甲基化模型。

根据甲基化标注物构建模型预测生存率 图片来源:PNAS


2.1.4肿瘤耐药性机制研究

2015年,David T. Miyamoto等人从13位出现雄激素抵抗(AR)的患者体内收集了77份循环肿瘤细胞,并完成了单细胞转录组测序分析。通过比对出现AR的患者血样循环肿瘤细胞,与未进行治疗患者样品,发现AR抗性组出现了nc-Wnt信号通路被激活的现象。nc-Wnt信号通路是调控细胞生存,增殖与运动功能的信号途径,通过增强nc-Wnt信号通路表达从而使细胞生存更久和增殖更快,从而产生耐药性。

过表达nc-Wnt通路基因,耐药性上升 图片来源:Science


2016年,Itay Tirosh等人对来自19名黑色素瘤病人、共计4645个肿瘤细胞样本进行单细胞转录组测序,其细胞类型包括了恶性肿瘤细胞,免疫细胞,间质细胞和内皮细胞。研究表明:在同种肿瘤中的恶性细胞,其转录的异质性与细胞周期,空间分布和抗药性相关。通常,恶性黑色素肿瘤具有以下两种特征:高表达MITF转录因子,或低表达MITF转录因子同时具有较低的AXL受体络氨酸激酶水平。MITF是皮肤中黑色素细胞的主要调节基因,在药物治疗中,容易被杀死,而高表达AXL的肿瘤细胞则不会被药物杀死。


WM88和MELHO两个细胞系中,AXL高表达细胞不会被杀死,随药物浓度增加AXL高表达细胞比例逐渐增高 图片来源:Science


2.2以临床为目的的应用

2.2.1监控肿瘤发展进程,合理用药

由于肿瘤细胞突变率高,若少量细胞产生抗药性,会随着药物使用,虽然大量肿瘤细胞被杀死,但具有抗药性的细胞迅速扩增,最终导至药物失效。最理想的状态是在抗药性肿瘤细胞大量繁殖之前转换药物,这就需要了解抗药性发生的机制,从而选择合适的参数监控肿瘤进程,及时换药。

CTC(循环肿瘤细胞,CirculatingTumorCell)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称。通过捕捉CTC,使用单细胞测序技术,监测其类型和数量变化的趋势,可以达到实时监测肿瘤发展动态的效果。

2016年,Wei Wei等人使用单细胞蛋白质组测序的方法,在用mTOR激酶抑制剂治疗之前和之后,收集患者来源的脑癌胶质母细胞瘤模型细胞中12种蛋白质和磷蛋白的蛋白质组学数据。然后使用蛋白质表达水平之间的相关性来构建信号传导网络,并且在靶向治疗之前和之后比较这些网络。药物降低mTORC1 / C2信号传导(预期靶标),但在达到抗药状态时,信号再次被激活。此外,在达到抗药状态时,可以在ERK / Src途径中看到与抗药的相关性。这表明这些途径中信号传导的增加可能促进下游mTOR信号传导,因此有效的靶向治疗必须同时靶向两条途径。针对性地联合用药后,肿瘤的生长得到了有效的抑制。

C+D/C+U/C+U+D联合用药有效抑制肿瘤生长 图片来源:Cancer Cell


2.2.2免疫治疗效果预测

抗PD-1免疫疗法在治疗转移性黑素瘤和其他肿瘤十分有效,然而仍有很大比例的患者没有表现出持久的反应。因此若能在用药前预测出药物疗效,则可对适用人群合理用药。

2018年,Carsten Krieg等人使用高维单细胞CyTOF质谱流式技术检测了在抗PD-1免疫疗法12周之前和之后的IV期黑素瘤细胞,并进一步研究了患者外周血中免疫细胞亚群。通过研究发现响应抗PD-1免疫疗法的总体存活的有效预测因子是CD14 + CD16-HLA-DRhi单核细胞的频率。

按照预测因子(单核细胞频率)分类,总体存活率比较图

图片来源:Nature Medicine


2.3以工业为目的的应用

2.3.1抗体筛选

抗体筛选主要有杂交瘤融合技术、噬菌体展示技术和新一代的B细胞克隆技术。B细胞克隆技术首先分离出表达抗体IgG的B细胞,再通过单细胞分离技术,分离出单个B细胞再将其中编码抗体重链和轻链的基因克隆出来,最后通过体外重组表达进行验证,从而获得所需要的单克隆抗体。其中获得B细胞编码抗体的基因序列是关键,通过单细胞测序平台,可以测得单个细胞的抗体重链和轻链。单细胞高通量测序技术的发展,使得分析抗体基因序列,特别是针对大容量、多样性高的抗体基因库序列的系统分析成为可能。


B细胞克隆技术流程图 图片来源:安必奇生物科技



竞争格局


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