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液态活检面面观(上)

2019-6-6| 编辑: 小桔灯网| 查看: 389| 评论: 0|来源: 靶向分子诊断丨作者:温焕焕

摘要: 液体活检即循环肿瘤组学,是精确肿瘤学的创新领域,可以克服当前组织活检的局限性。 肿瘤循环组学中,循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)是美国FDA唯一批准用于指导临床应用的。 细胞外囊泡(EV),循环肿瘤 ...


液体活检即循环肿瘤组学,是精确肿瘤学的创新领域,可以克服当前组织活检的局限性。 肿瘤循环组学中,循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)是美国FDA唯一批准用于指导临床应用的。 细胞外囊泡(EV),循环肿瘤RNA(ctRNA)和肿瘤教育/修饰的血小板(TEP)是相对较新的肿瘤组成成分,但在癌症治疗的每个阶段都具有很大潜力。 本文主要讨论肿瘤循环组学各成分的临床应用以及目前限制其在临床应用实施的主要因素。 


液体活检:肿瘤循环组学circulome

癌症是全球死亡的主要原因之一, 2018年癌症死亡人数约为960万。2018年美国约有超过1 735 350例癌症被诊断,癌症造成超过609 640例患者死亡。 “组学”技术的发展引领了精准肿瘤领域的发展,即针对每个肿瘤患者的不同分子学特征制定个体化治疗方案。



肿瘤循环组学来自于肿瘤组织,可以直接或间接用作液体活检的肿瘤生物标志物。它包括循环肿瘤蛋白、循环肿瘤(ct)DNA、循环肿瘤细胞(CTC)、肿瘤衍生的细胞外囊泡(EV)及其成分、循环肿瘤(ct)RNA和肿瘤教育/修饰血小板(TEP)。每个成分都可提供多种生物学信息。ctDNA可检测到基因突变、缺失、基因扩增、甲基化和易位。 CTC提供丰富的基因组学、蛋白质组学、转录组学和细胞遗传学信息,并且可以离体培养以进行个性化的药物敏感性测试。 EV提供了肿瘤起源的“分子指纹”,并且其DNA、RNA和蛋白质(表面和腔内)提供了丰富的癌症生物标志物。 ctRNA,包括EV相关的循环RNA提供了不同的RNA类别。其中,miRNA表达组和长非编码(lnc)RNA表达提供定量生物标记物信息。也可定性信息,如肿瘤特异性可变剪接和基因融合的存在。癌症患者的血小板即TEP也是生物标志物,因为它们包含肿瘤衍生的RNA和肿瘤诱导的可变剪接的转录子。

目前肿瘤遗传谱分析的金标准仍是组织活检。鉴于其侵入性,组织活检具有许多局限性,如患者手术风险、样品制备、灵敏度和准确性、手术成本和侵入性。这使得组织活检无法应用于临床患者纵向监测。此外,组织活检的最大局限性在于无法捕获肿瘤内和转移病灶间的遗传异质性,影响了检测的准确性。

液体活检可以克服组织活检的局限性。可应用于临床癌症的诊断、筛查和预后。本文详细介绍了液体活检的临床意义和应用潜力,并汇总了肿瘤循环组学作为癌症诊断和监测的生物标志物的最新文献报道。特别是ctDNA、CTC、肿瘤衍生的EVs和ctRNA。 本文还讨论了循环肿瘤组学在临床实践中的限制因素,并概述了克服这些因素的重大技术进展。

 

循环肿瘤DNA

ctDNA是指来自肿瘤细胞的游离DNA,肿瘤通过细胞凋亡、坏死、CTC溶解以及分泌(外泌体)到血液中。


ctDNA的临床意义

ctDNA可提供定性和定量信息。 定量信息,即突变等位基因比(MAF,靶基因突变等位基因的百分比)的测量中获得,表示肿瘤负荷。可用于检测微小残留病(MRD)和隐匿性转移以及监测治疗反应和治疗效果。ctDNA水平提供肿瘤体积的“实时”快照,因为crDNA的半衰期短(~2.5 h)。 ctDNA是治疗后监测疾病复发的高灵敏度和高特异性预测因子。

定性信息,即分析ctDNA中的突变,扩增,缺失和易位等遗传信息的改变,从而指导个性化治疗方案的制定。例如,FDA批准的第一个基于ctDNA的伴随诊断(cobas®EGFRMutation Test v2; Roche Diagnostics)用于指导EGFR敏感突变的NSCLC患者EGFR-TKI的使用。也可分析ctDNA甲基化状态。例如,美国FDA批准了结直肠癌(CRC)的筛查检测,用于检测SEPT9基因启动子的甲基化。


技术方法和限制

目前ctDNA检测常用方法有PCR或新一代测序(NGS)。 等位基因特异性PCR是ctDNA检测使用的第一种方法,cobas®EGFR技术采用的的定量PCR(qPCR)。总cfDNA中ctDNA的占比非常低,通常<0.01%。目前已开发出高敏感度技术并成功用于ctDNA分析,如数字PCR(dPCR)、液滴数字PCR( ddPCR)、珠子乳剂扩增磁性(BEAMing)技术。 虽然这些技术灵敏度高、检测快速且相对便宜,但基于PCR的技术受到低通量的限制,只能分析有限数量的基因位点。

NGS技术的灵敏度低于PCR技术,并且灵敏度与与分析的基因位点数成反比,全外显子组测序(WES)具有最低的灵敏度(≥5%MAF)。增强NGS敏感性的方法可以考虑患者或癌症特异性基因组,例如通过深度测序(CAPP-Seq)技术进行癌症个性化分析,或在文库制备期间抑制由随机错误产生的背景噪音,这些方法需使用独特的分子标签(UMI)标记每个模板。不同的NGS平台均在使用上述方法,例如增强型标记扩增子测序(eTAm-Seq™)。 增强灵敏度的另一种方法是使用选择性核酸酶消化非突变DNA,这导至MAF增加并可检测低至0.00003%MAF的突变。

尽管ctDNA应用于液体活检具有潜力,但仍具有许多局限性。检测灵敏度是最严重的问题,特别是在早期癌症检测中,ctDNA含量低可能导至MAF低于现有技术的检测限。此时,其他体液如接近肿瘤推定部位的取样可以提高检测率,尤其是具有遗传易感基因的高危个体的检测。因为在肿瘤早期阶段,近端体液中可能比血液具有更高浓度的肿瘤衍生DNA。早期检测的另一个应用是单个或小组突变的预测作用,因为在健康个体的血浆中仍可发现癌症相关突变,这是克隆性造血导至的。应用CancerSEEK平台可避免该问题,该平台将8种肿瘤衍生蛋白与ctDNA突变谱相关联,其特异性> 99%。

另一个限制ctDNA在临床实践中应用的问题缺乏用于分析前样品制备和ctDNA纯化的标准化方案。目前的操作程序复杂并可能导至ctDNA降解和血细胞溶解。

急需一种快速、一步纯化ctDNA的平台,芯片实验室系统有可能满足这一需求。


循环肿瘤细胞

CTC是从原发肿瘤部位分离出的肿瘤细胞群,可在患者的外周血中检测到。CTC被认为是肿瘤转移发展的基础[31]。 CTC通过主动内渗、上皮-间质转化(EMT)或者或原发肿瘤被动脱落达到血液中。血液中CTC聚集体或循环肿瘤微栓子(CTM)证明了后一种机制。

CTC的临床意义及分析技术

CTC可提供定量信息以及单细胞基因组、转录组学和/或蛋白质组学(定性)信息。 CTC可用于诊断、监测、预后和疗效预测,也可用于发掘具有应用潜力的新药物靶点。 此外,离体培养CTC具有重要的翻译价值,可利用CTC进行个性化的药物敏感性测试,根据肿瘤突变谱和药物敏感性结果指导个体化治疗决策。

CTC的数量是许多癌症的预后预测因子,包括转移性乳腺癌、结肠癌和前列腺癌。 目前FDA唯一批准CellSearch®平台用于CTC临床应用,用于上皮CTC的计数。 METABREAST试验(clinicaltrials.gov标识符:NCT01710605)正在研究CTC作为转移性乳腺癌患者的一线治疗的选择标准。

ctDNA分析技术可用于CTC分析,从而获得遗传和基因组信息,包括qPCR和基于dPCR的突变分析以及靶向NGS和全基因组测序。此外,CTC可用于细胞遗传学分析,如荧光原位杂交(FISH),用于鉴定染色体重排。 NGS技术在单CTC基因组和转录组学表征、肿瘤异质性研究以及组织活检的比较分析中具有重要应用。单细胞基因组学和转录组学已取得显着发展,但使用单一的免疫组织化学和流式细胞术进行单CTC蛋白质分析有些为时过早。新技术正在开发,如Sinkala及其同事最近开发了一种基于微流体的scWB技术,可评估单个CTC中的8种蛋白质。

尽管有许多分析平台和技术可用于CTC分析,但在临床实践中的应用仍受到血液分离的限制。存在的挑战还包括CTC细胞的极端稀有性、脆弱性、物理和表型异质性。 目前CTC的富集和分离主要利用其生物和物理特性,而功能测定可用于CTC鉴定。每一种方案都有其优点和缺点,不同方法的组合才能获得更全面的表征。

(未完待续)






文本要点

液体活检作为传统组织活检的有力补充方案,为癌症生物标志物的检测和监测提供了一种非侵入性方法。

FDA批准的肺癌伴随诊断方法和基于ctDNA分析的结直肠癌筛查方法是临床应用液体活检的重要里程碑。

FDA批准CellSearch®CTC方法计数CTC,用于预测乳腺癌、结肠直肠癌和前列腺癌。




参考来源:

G De Rubis, et al. Liquid Biopsies in Cancer Diagnosis, Monitoring, and Prognosis. Trends in Pharmacological Sciences, Volume 40, Issue 3, March 2019, Page 172-186.

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